猪源乳酸杆菌的分离鉴定及其发酵培养条件优化

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1、猪源乳酸杆菌的分离鉴定及其发酵培养条件优化　摘要微生态制剂是发展绿色养猪业的关键，乳酸杆菌是目前应用的微生态制剂中最重要的有益菌组成成分之一。分离、鉴定并筛选出1株耐酸和耐胆盐能力较强的乳酸杆菌，命名为乳酸杆菌L5株。采用单因素法和正交试验设计法对其发酵培养条件进行了优化，发酵培养菌落总数可达8.25108cfu/mL。　　关键词猪源乳酸杆菌；分离鉴定；发酵条件；优化　　　　中国.Ling-yue　　（FuyangVocational-technicalCollege，FuyangAnhui2360

2、31）　　AbstractProbioticsisthekeytodevelopinggreenpigindustry.Lactobacillusisoneofthemostimportantbeneficialbacteriumponentsinthecurrentapplicationprobiotics.OneLactobacillusstrainedLactobacillusstrainL5.Thefermentationconditionsinliquidculturealconditio

3、ns，thelivingbacteriaconcentrationreached8.25108cfu/mLinthefermentationliquid.　　Keysentationcondition；optimization　　　　由于长期大量使用抗生素和化学药物的弊端日益明显，使得微生态制剂在畜牧养殖业的应用成为必然。微生态制剂进入肠道可以通过与肠道有害菌群的竞争占位、夺氧等竞争性抑制或分泌抗性物质、酶和有机酸等作用使得肠道内有益菌群成为优势种群，进而调整肠道微生态平衡，达到有利于消化、健康的作

4、用。因此，在仔猪饲料中添加微生态制剂，可明显降低仔猪肠道疾病的发病率、提高仔猪成活率和生长率[1]。　　我国是养猪大国，微生态制剂的应用是发展绿色养猪业的关键。目前微生态制剂应用较多的主要有乳酸菌类制剂、芽孢杆菌类制剂、双歧杆菌类制剂、光合细菌类制剂和真菌类制剂等。其中，乳酸杆菌（Lactobacillus）在肠道中生长繁殖，抑制有害菌生长，是动物机体内正常的生理菌群之一。乳酸杆菌能够合成共轭亚油酸（ConjugatedlinolEicacid，CLA），产生乙酸和乳酸，降低肠道pH值，从而提高动物

5、的免疫力和生产性能[2]；此外，乳酸杆菌一方面可刺激肠道局部的免疫反应，另一方面通过粘附于肠道黏膜细胞上，而对肠道黏膜产生占位性保护作用。笔者从健康仔猪的肠道中分离有益的乳酸杆菌，并进行了其发酵培养基和培养条件的优化研究，为进一步研制猪用微生态制剂奠定基础。现将研究结果报告如下。　　1材料与方法　　1.1试验材料　　供试材料：取健康的15日龄长白猪仔猪小肠黏膜。供试培养基：供试基础培养基，即乳酸杆菌选择性培养基，按照陈天寿[3]的方法进行配制；生化培养基按照赵斌等[4]的方法配制。试验试剂：试验所使

6、用的各种试剂均按照赵斌等[4]的方法配制。　　1.2试验方法　　1.2.1乳酸杆菌分离。将健康的15日龄仔猪麻醉处死，通过无菌操作刮取1g小肠黏膜，经适当稀释后涂布在MRS琼脂平板上，于37℃厌氧条件下培养48h。挑取颜色、大小、形状、边缘、分布位置各异的单菌落，在MRS琼脂培养基上划线得到纯培养。通过革兰氏染色镜检，挑选染色结果为革兰氏阳性、不产芽孢的杆状菌株，以备后续试验用。　　1.2.2乳酸杆菌鉴定。将挑选出来的菌种依次从形态、理化特性、代谢产酸等方面按《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）进行鉴定

7、[5]。　　1.2.3乳酸杆菌耐酸性试验。菌液接种于MRS培养液中，其pH值分别为2.0、3.0、4.0、6.8（对照），并在37℃条件下分别处理1、2、3h，通过保温前后活菌计数结果计算细菌存活率。　　1.2.4乳酸杆菌胆盐耐受性试验。菌液接种于胆盐浓度分别为0（对照）、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的MRS培养液中，在37℃条件下处理3h后，平板菌落计数，筛选出对酸和胆盐耐受能力均较强的菌株进行后续的试验。　　1.2.5乳酸杆菌生长曲线测定。将保存的菌种用MRS液体培

8、养基活化。将活化的菌种以5%（v/v）的接种量接入MRS液体培养基，37℃培养48h，其中每隔2h取样1次测定菌液的OD值（600nm）和pH值，用未接种的培养液作空白对照。　　1.2.6发酵培养基营养成分的确定。在MRS液体培养基的基础上，分别添加2%葡萄糖、红糖、蔗糖作为不同的碳源；分别加入1%胰蛋白胨、大豆蛋白胨和鱼肉蛋白胨作为不同的氮源；分别加入0.5%K2HPO4和KH2PO4、β-磷酸甘油二钠以及Na2HPO4和NaH2PO4作为不同的磷源；分别