永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

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1、永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性作者：李羽，白雪帆，王军，徐哲，张岩【关键词】永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体　　Establishmentandbiologicalcharacterizationofanimmortalizedhumanfetalhepatocyteline　　　【Abstract】AIM:Toestablishanimmortalizedhumanfetalhepatocytelineandtostudyitsbiologicalcharacteristics

2、andfunctions.METHODS:HumanfetalhepatocytesianVirus40largeTantigen.Characteristicsoftheimmortalizedfetalhepatocytelineorphologicandfunctionaldetection.RESULTS:Oneofthehepatocyteclonesdisplayinghighlydifferentiatedinliverfunctionandimmortalizedcharacteristic

3、shadbeenscreenedafter40dayselectionof700-300mg/LG418.Theimmortalizedhepatocytelinemaintainedthemostmorphologiccharacteristicsofprimaryhepatocyte.Thecellcloneformingratmortalizedhumanfetalhepatocyteshadanormalkaryotypeandinandtheimmunohistochemicaltestshoed

4、cellgenome.CONCLUSION:Theimmortalizedhumanfetalhepatocytelinehasthesimilarmostmorphologiccharacteristicsandbiologicalfunctiontoprimaryhepatocytes,anditaterialonthestudyofbioartificialliverandhepatocytetransplantation.　　【Keymortalized;hepatocytes;cellline;c

5、haracterization;SV40;liposomes　　【摘要】目的:构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究.方法：利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能.结果：经G418700～300mg/L筛选，40d后获得一株阳性克隆.形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征.永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%，染色体核型分析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软

6、琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能.结论：新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.　　【关键词】永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体　　【中图号】R512.6　　0引言　　原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段.但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命.研究显

7、示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择［1-5］.而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择.从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理

8、想而充足的细胞材料.　　1材料和方法　　1.1材料含有SV40LargeT抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘广芝教授惠赠，真核表达质粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存.14～28a公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.　　1.2方法　　1.2.1重组质粒的构建及鉴定提取含SV40LargeT的pcD2