人肝星状细胞系的建立及其生物学特性研究

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1、厦门大学硕士学位论文人肝星状细胞系的建立及其生物学特性研究姓名：刘建明申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：王效民201204摘要摘要背景和目的肝细胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上最常见的五大恶性肿瘤之一，每年约有500，000新发病例；尤其是在亚洲，因为乙型肝炎病毒(hepatitisBvinJjs，HBv)的感染率高，一些国家HCC发病率非常高，而西方一些国家由于丙型肝炎患者增多，HCC发病率也逐年升高。我国是HCC的高发国家，发病率居世界首位，死亡率位于恶性肿瘤死亡率的第二位。肝星状细胞(Hepaticstella

2、teCell，HSC)是肝癌微环境中的主要基质细胞，研究表明，它在促进肝癌的发生、发展方面发挥着重要作用。然而，现有的性状稳定的肝星状细胞系的种类仍然比较有限而且不易获得，而且临床手术标本来源有限，限制了研究的进一步开展。本实验的研究目是通过建立生物学性状稳定的人肝星状细胞系，以克服这一障碍，为后续实验研究提供可靠的细胞来源。实验方法我们首先运用胶原酶消化及percoll密度梯度离心的方法获得纯度高的人肝星状细胞，并对其进行初步鉴定，然后通过慢病毒感染的方法，将人端粒酶基因hTERT导入原代肝星状细胞，用G418进行药物筛选，构建新的人肝星状细胞系(hⅡ!RT-h

3、HSC)。我们通过RealtimePCR和免疫蛋白印迹等方法检测hTERT．hHSC的生物学特征。运用增殖实验、划痕实验及侵袭实验分别检测hTERT_hHSC是否能具有促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等肝星状细胞的特性。结果我们成功分离纯度高的人肝星状细胞。慢病毒感染将hTEI盯基因成功导入Prirna珂一hHSC，并使hTERT-hHSC具有端粒酶活性。hTERT-hHSC基因表达情况基本与P血na巧．hHSC相同，除MMP．2、TIMP．2、MMP．14、PDGF．B表达量升高(P

4、蛋白印迹显示hTERT-hHSC细胞Q．SMA、PDL．1及PDFGR-p表达量同培养活化的肝星状细胞。hTERT-hHSC促进HepG2细胞增殖、迁移及侵袭。结论我们通过密度梯度离心的方法成功分离纯化人肝星状细胞，通过慢病毒感染的方法，成功建立生物学性状稳定的人肝星状细胞系hTERT-hHSC。关键词：肝癌，肝星状细胞，端粒酶Abst瞰AbstractBacl【gro蛐dandaimsH印atocellularcarcinoma(HCC)isacoIlllTlonworld诵demali印a11cy．HoweVer，Comprel】e11sive触a恤entis

5、f01lowedbyp00rpr0印osis．Acc啪ulatingreponssuggeSted也athepaticstellatecellsmSCs)criticalrolesinhepatocellularcarCillomaf0肌ationandprogression，andshouldberesponsiblefortlleoccurrence锄ddeVelopmentofhepa幻cellularcarcinoma(HCC)．Here，weusedh啪aIltelomerasereverSet船IlscriptaSe(hTE啪iIlductiontoe

6、stablishanewh啪mh印aticstellatecelllille，ternl枷巳RT-llHSC，iIlordert00Verc锄etheiIlsu伍cientsupplyofqualifiedHSC．MethodsHere，weusedblun孤teIomerasereVersetmscriptase(hTEI汀)inductiont0e鼬lishanewh啪觚hepaticstellatecellline，temhTERT-llHSC．Cellswere锄nsfected谢n1packagedVinlScontaillinghTERlT，follo

7、嘶gG4l8selection．Single-cellcloIlingⅥ邯nlenperf．0眦edusingmelimiteddilucionmetllod．Inordert0dete吼inech撇ctefsofhTERT．1lHSC，WeStemblotaIldReal—timePCRwerepe怕锄ed．Co—culturesystemwereuSedtoevaluateinVaLsionand．mmi肿tionabilityofhl迮Kr-hHSC．ResultsNewlyisolatedhHSCexKbited咖icalmo叩hology．hIullun

8、ocyto