胃癌腹膜高转移潜能细胞系的建立及其生物学特性

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1、胃癌腹膜高转移潜能细胞系的建立及其生物学特性【摘要】目的利用人胃癌细胞系（GC9811）在裸小鼠体内反复接种建立一株具有腹膜高转移潜能的胃癌细胞系(GC9811P)，并对其生物学特性进行观察，为实验研究提供模型。方法采用胃癌细胞系(GC9811)在裸小鼠腹腔内反复接种，行体外培养腹膜转移灶筛选高转移亚系，绘制细胞生长曲线，光镜、电镜下观察细胞形态，利用流式细胞仪、染色体分析等方法，研究该高转移亚系的细胞周期、增殖、染色体核型等生物学特性。结果母本细胞系GC9811腹膜转移形成率为33.3%(3/10)，而GC9811P

2、腹膜转移形成率为100%。两种细胞系腹膜结节组织学形态大体相似。增殖速度较母系加快。细胞周期分析G1期53.5%、G2期12.5%、S期37.1%。且遗传学特性包括染色体形态仍为人类核型，众数维持在104～126之间，占70%。结论具有腹膜高转移的胃癌细胞系GC9811P的建立及裸小鼠体内实验模型，为研究胃癌腹膜转移机制及探索新的治疗途径提供了极为有用的工具。【关键词】胃癌腹膜转移细胞系　　0引言　　为研究胃癌浸润与转移机制及探索阻断其浸润与转移策略，本研究采用胃癌细胞系GC9811细胞悬液于腹腔接种，经体外培养腹膜转移

3、结节，成功地建立了胃癌腹膜高转移细胞系GC9811P，并对其生物特性进行了初步鉴定。　　1材料和方法　　1.1细胞系和细胞培养GC9811人胃癌细胞系由西京医院全军消化病研究所提供，细胞置20%小牛血清的RPMI1640培养液中于CO2恒温孵箱中培养，常规传代；BALB/CNU/NU裸鼠，由中国生物药品鉴定所提供，鼠龄3～5周，体重15～20g，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，无菌食物和水由裸小鼠自由摄取。　　1.2方法　　1.2.1高转移亚系的筛选用0.02%EDTA和0.125%的胰蛋白

4、酶联合消化对数生长期的GC9811细胞，用无血清的RPMI1640培养液洗涤3次，制备成1×107细胞悬液，接种于裸鼠腹腔，3周后，裸鼠出现全身衰竭，断颈处死，收集腹膜瘤结节行体外培养，获得的细胞系命名为GC9811P1，于体外培养2～3代后，收集细胞再行裸鼠腹腔接种，用同样的方法重复4次，得到高转移细胞系GC9811P4。采用有限稀释法，在96孔板中将GC9811P4细胞稀释成每孔含0.5～1个细胞，次日在倒置显微镜下观察并挑选只含一个细胞的孔，待细胞增殖近面积1/3时，移至24孔板中扩大培养，得到胃癌腹膜高转移

5、细胞株GC9811P。　　1.2.2形态学检查每只裸鼠均详细解剖，对肉眼未发现转移灶的肺脏进行连续切片，癌组织石蜡包埋、切片、HE染色，培养细胞用倒置显微镜观察，收集对数生长期的细胞，用30ml/L的戊二醛固定，树脂包埋，超薄切片并染色，以日立JEM2000型透视电镜及扫描电镜观察细胞超微结构。　　1.2.3细胞增殖特性的研究用MTT法测定细胞生长曲线。调整GC9811与GC9811P细胞浓度,分别按1×103个细胞/孔接种于96孔板中，每孔加200μl培养液，置37℃、CO2孵箱中培养，每个样品重复3孔，每天用MT

6、T比色法测定3孔中的A职（为490nm），绘制细胞生长曲线。流式细胞仪测定细胞周期及DNA含量：收集对数生长期的GC9811与GC9811P细胞用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA溶液联合消化细胞，制备单细胞悬液，用PBS洗涤两遍，垂悬于5ml、4℃预冷的PBS中，95%的乙醇固定，调整细胞数为1×105/ml，经溴化乙锭染色后，在流式细胞仪上测定细胞周期及DNA含量。　　1.2.4体外侵袭实验参照Albini等体外侵袭实验方法。Boyden(Biotech公司)小室上下室之间铺有直径为6.5mm的聚碳酸酯微孔滤膜

7、（孔径为8μm），膜上均匀铺人工基底膜胶（matrigel）50μɡ/孔，下室加入NIH3T3细胞无血清条件培养上清200μl作为趋化因子，将小室置于37℃温箱中聚合30min。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，向上室中加入细胞悬液400μl，37℃，5%CO2孵箱中放置12h。弃上室液体，拭尽膜上未侵袭的细胞及人工基底膜胶，甲醇固定30min，常规HE染色。每个细胞同时做3个小室，200倍光镜下将膜以水平线及垂直线分为4个象限，在每个象限及膜中心取1个视野记数，取其均值。　　1.2.5染色体分析取对数生

8、长期的GC9811P细胞，按文献[2]所述方法制片，镜检100个分散良好且完整的中期分裂相进行染色体分析。　　1.2.6双层琼脂试验按常规方法检测克隆形成率。　　1.2.7支原体检测采用透射电镜、地依红染色及肉汤培养法检测培养液及细胞内支原体。　　1.2.8体内成瘤性检测将生长旺盛的GC9811与GC