永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

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1、永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性李羽，白雪帆，王军，徐哲，张岩【关键词】永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体　　Establishmentandbiologicalcharacterizationofanimmortalizedhumanfetalhepatocyteline　　　【Abstract】AIM:Toestablishanimmortalizedhumanfetalhepatocytelineandtostudyitsbiologicalcharacteristicsandfunctions.METHODS:Humanfet

2、alhepatocytesianVirus40largeTantigen.Characteristicsoftheimmortalizedfetalhepatocytelineorphologicandfunctionaldetection.RESULTS:Oneofthehepatocyteclonesdisplayinghighlydifferentiatedinliverfunctionandimmortalizedcharacteristicshadbeenscreenedafter40dayselectionof700-300mg/LG418.Th

3、eimmortalizedhepatocytelinemaintainedthemostmorphologiccharacteristicsofprimaryhepatocyte.Thecellcloneformingratmortalizedhumanfetalhepatocyteshadanormalkaryotypeandinandtheimmunohistochemicaltestshoedcellgenome.CONCLUSION:Theimmortalizedhumanfetalhepatocytelinehasthesimilarmostmor

4、phologiccharacteristicsandbiologicalfunctiontoprimaryhepatocytes,anditaterialonthestudyofbioartificialliverandhepatocytetransplantation.　　【Keymortalized;hepatocytes;cellline;characterization;SV40;liposomes　　【摘要】目的:构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究.方法：利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的

5、人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能.结果：经G418700～300mg/L筛选，40d后获得一株阳性克隆.形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征.永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%，染色体核型分析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能.结论：新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.　　【关键词】永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；

6、脂质体　　【中图号】R512.6　　0引言　　原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段.但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命.研究显示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择〔1-5〕.而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择.从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，

7、但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理想而充足的细胞材料.　　1材料和方法　　1.1材料含有SV40LargeT抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘广芝教授惠赠，真核表达质粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存.14～28a公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.　　1.2方法　　1.2.1重组质粒的

8、构建及鉴定提取含SV40LargeT的pcD2质粒，