供者淋巴细胞输注治疗小鼠h22肝癌的实验研究

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1、供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究作者：曾冬香，姜藻，毕延智，张琰［摘要］目的:观察供者淋巴细胞输注（DLI）对小鼠H22肝癌的治疗作用。方法:荷瘤昆明小鼠分荷瘤对照组（A组）、5.氟脲嘧啶（5.FU）化疗组（B组）、DLI组（C组）及5.FU加DLI组（D组）4组。比较各组小鼠生存期、抑瘤率及瘤体病理检查结果，检测NK细胞及IL.2的活性。结果:B、C组生存时间长于A组（P<0.01），D组长于C组（P<0.01）;B、C、D各组抑瘤率依次为61.3%、34.7%、89.5%;C、D两组NK细胞及IL.2活性明显高于A、B

2、组（P<0.05）;病理观察见C、D组大量炎性细胞浸润。结论:DLI对小鼠H22肝癌有治疗作用，是一种潜在可行的实体瘤细胞过继免疫治疗方法。　　［关键词］肝癌;供者淋巴细胞输注;移植物抗肿瘤效应;免疫治疗;小鼠　　随着现代生物技术的发展，生物治疗已逐渐成为治疗肿瘤的重要手段之一。目前LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞等过继性细胞免疫疗法都是给患者回输其自身的淋巴细胞。本研究通过向荷瘤小鼠体内输注正常的供者淋巴细胞，诱导特有的异体抗肿瘤反应来攻击肿瘤，探索一种新的实体瘤过继免疫治疗方法。　　1材料与方法　　1.1动物　　BALB.C小鼠、KM

3、小鼠，雌性，均为8～10周龄，体重18～22g，由东南大学医学院实验动物中心提供。　　1.2试剂　　环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;5.氟脲嘧啶（5.FU）为天津金耀氨基酸有限公司产品。　　1.3实体型荷瘤鼠模型建立　　无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤细胞超过90%，调细胞浓度为1×107ml-1，分别取0.2ml接种于KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。　　1.4实验分组　　共分4组，每组10只（另备3只中途处死）。A组（荷瘤对照组）:不作任何处理;B组（5.F

4、U化疗组）:接种后第3天开始化疗，5.FU20mg・kg-1腹腔注射，连续用药7d;C组［供者淋巴细胞输注（donorlymphocytein-fusion，DLI）组］:接种前11d经脾细胞加CP加供体脾细胞输注的方法［1］诱导对BALB.C小鼠的特异性免疫耐受状态，接种后第3、10、17天尾静脉注射供鼠BALB.C脾脏淋巴细胞，细胞数分别为0.5×107、0.5×107及1×107只-1。D组（5.FU加DLI组）:接种前4d诱导免疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第10、17、24天予DLI，细胞数同C组。　　1.5观

5、察指标　　1.5.1生存时间记录接种当天开始至小鼠死亡的时间，计算各治疗组生命延长率。　　1.5.2抑瘤率待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长短径，比较瘤体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑瘤率。肿瘤体积=长径×短径2.2;抑瘤率=（对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积）.对照组肿瘤体积×100%。　　1.5.3瘤体光镜下组织病理学观察接种后第15天各组处死3只小鼠取瘤体，固定包埋切片，HE染色光镜观察。常规无菌取脾，制备脾细胞悬液以备检测。　　1.5.4NK细胞杀伤活性（NKCA）检测参照　　A、B、C、D各组NK细胞活性依次为16.9±2.8

6、、35.9±3.1、78.4±5.5和47.3±3.7，正常小鼠为66.2±4.9。A组NK细胞活性较正常小鼠明显下降（P<0.05），B组与A组比较差异无显著性（P>0.05），C组NK细胞活性达正常水平（与A组比较，P<0.05），D组与其余各组比较均有显著差异（均为P<0.05）。　　2.4IL.2的产生及其活性　　A、B、C、D各组IL.2活性依次为0.258±0.260、0.218±0.016、0.325±0.044和0.393±0.028，正常小鼠为0.378±0.064。A组IL.2活性明显低于正常小鼠（P&

7、lt;0.05），B组与A组比较差异无显著性（P>0.05），C、D两组IL.2活性达正常水平（与A组比较，均为P<0.05）。　　2.5光镜下瘤体组织病理学变化　　光镜下各组肿瘤组织均有不同程度的出血、坏死，其中B组纤维化明显，C、D两组瘤组织大片坏死，瘤细胞变小，核固缩、变性，间质内有大量炎性细胞浸润（图1），以淋巴细胞及巨噬细胞多见，D组还可见大量增生的淋巴滤泡（图2）。　　图1C组瘤体光镜下组织病理学改变×100　箭头示间质内大量炎性细胞浸润（略）　　图2D组瘤体光镜下组织病理学改变×100箭头示增生的淋巴滤泡（略）　　3讨论

8、　　早在20世纪70年代就有报道，用胸导管分出来的供者淋巴细胞不经任何预处理输入来治疗恶性肿瘤并取得暂时性的疗效［4］。近年来，非清髓异