供者淋巴细胞输注治疗小鼠h22肝癌的实验研究论文

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1、供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究论文.freelide，CP）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;5.氟脲嘧啶（5.FU）为天津金耀氨基酸有限公司产品。1.3实体型荷瘤鼠模型建立无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤细胞超过90%，调细胞浓度为1×107ml-1，分别取0.2ml接种于KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。1.4实验分组共分4组，每组10只（另备3只中途处死）。A组（荷瘤对照组）:不作任何处理;B组（5.FU化疗组）:接种后第3天开始化疗，5.FU20mgkg-1腹腔注射，连续用药7d

2、;C组［供者淋巴细胞输注（donorlymphocytein-fusion，DLI）组］:接种前11d经脾细胞加CP加供体脾细胞输注的方法［1］诱导对BALB.C小鼠的特异性免疫耐受状态，接种后第3、10、17天尾静脉注射供鼠BALB.C脾脏淋巴细胞，细胞数分别为0.5×107、0.5×107及1×107只-1。D组（5.FU加DLI组）:接种前4d诱导免疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第10、17、24天予DLI，细胞数同C组。1.5观察指标1.5.1生存时间记录接种当天开始至小鼠死亡的时间，计算各治疗组生命延长率。1.5

3、.2抑瘤率待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长短径，比较瘤体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑瘤率。肿瘤体积=长径×短径2.2;抑瘤率=（对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积）.对照组肿瘤体积×100%。1.5.3瘤体光镜下组织病理学观察接种后第15天各组处死3只小鼠取瘤体，固定包埋切片，HE染色光镜观察。常规无菌取脾，制备脾细胞悬液以备检测。1.5.4NK细胞杀伤活性（NKCA）检测参照文献［2］的方法略有改动。取上述已制备的脾细胞悬液4×106ml-1，加入96孔培养板，每孔100μl，每只小鼠脾细胞设3个重复孔。取传代48h的H

4、22细胞，调细胞浓度为2×105ml-1，每孔加入100μl，使每孔效靶比为20∶1。平行设效应细胞对照孔。按MTT方法加人试剂并测OD值，依下式计算杀伤率:NKCA（%）=［1-（实验孔OD值-效应细胞对照孔OD值）.靶细胞对照孔OD值］×100%。1.5.5IL.2的诱生及其活性检测参照文献［3］T淋巴母细胞增殖分析法。（1）IL.2诱生:取上述已制备的脾细胞悬液5×106ml-1放入培养瓶，置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养40h，离心收集上清液，置-20℃冰箱保存备用。（2）制备活化的脾淋巴细胞:无菌取正常KM小

5、鼠脾脏，制成5×106ml-1细胞悬液，加入ConA使其终浓度为5mgL-1，置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养48h，收集细胞，离心洗涤2次，配成5×105ml-1细胞悬液作为检测IL.2的反应细胞。（3）IL.2活性检测:将待测小鼠脾细胞上清液用MTT比色法测定IL.2活性。1.6统计学处理所有数据采用SPSS统计软件进行分析，结果以ˉx±s或百分率表示，两样本均数比较采用t检验。2结果2.1小鼠生存情况各组小鼠100%死亡。A组生存时间（16.4±2.5）d;B、C组生存时间分别为（23.3±3.2）、（26.3±

6、3.1）d，较A组明显延长（P0.01）;D组小鼠平均生存期上升到（33.7±5.3）d，生命延长率105.49%，与其他3组相比大大提高（P0.01）。2.2小鼠肿瘤生长情况接种后第3天即可扪及瘤结节，A组随即迅速增大，C组增大速度稍慢。B、D两组用药后3d内肿瘤逐渐缩小，有些甚至完全消失;B组停药后3d左右肿瘤又逐渐增大;D组肿瘤复发时间延长至7d左右，再次DLI可控制瘤体生长。接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况见表1。表1接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况（略）1）与A组比较，P0.01;2）与B组比较，P0.01;3）与C组比较，

7、P0.012.3对H22肝癌小鼠NK细胞活性的影响A、B、C、D各组NK细胞活性依次为16.9±2.8、35.9±3.1、78.4±5.5和47.3±3.7，正常小鼠为66.2±4.9。A组NK细胞活性较正常小鼠明显下降（P0.05），B组与A组比较差异无显著性（P0.05），C组NK细胞活性达正常水平（与A组比较，P0.05），D组与其余各组比较均有显著差异（均为P0.05）。2.4IL.2的产生及其活性A、B、C、D各组IL.2活性依次为0.258±0.260、0.218±0.016、0.325±0.044和0.393±0.028

8、，正常小鼠为0.378±0.064。A组IL.2活性明显低于正常小鼠（P0.05），B组与A组比较差异无显著性（P0.05），C、D两组IL.2活性达正常水平（与A组比较，均为P0.05）。2.5光镜下瘤体组织病理学变化