供者淋巴细胞输注治疗小鼠h22肝癌的实验研究.doc

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1、供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研宄作者：曾冬香，姜藻，毕延智，张琰［摘要］目的：观察供者淋巴细胞输注对小鼠H22肝癌的治疗作用。方法：荷瘤昆明小鼠分荷瘤对照组、5•氟脲嘧啶化疗组、DLI组及加DLI组4组。比较各组小鼠生存期'抑瘤率及瘤体病理检查结果，检测皿细胞及的活性。结果:B、C组生存时间长于A组，D组长于C组;B、C、D各组抑瘤率依次为％、％、％;C、D两组NK细胞及活性明显高于A、B组；病理观察见C、D组大量炎性细胞浸润。结论:DLI对小鼠H22肝癌有治疗作用，是一种潜在可行的实体瘤细胞

2、过继免疫治疗方法。［关键词］肝癌；供者淋巴细胞输注;移植物抗肿瘤效应;免疫治疗;小鼠随着现代生物技术的发展，生物治疗已逐渐成为治疗肿瘤的重要手段之一。目前LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞等过继性细胞免疫疗法都是给患者回输其自身的淋巴细胞。本研究通过向荷瘤小鼠体内输注正常的供者淋巴细胞，诱导特有的异体抗肿瘤反应来攻击肿瘤，探索一种新的实体瘤过继免疫治疗方法。1材料与方法动物小鼠、KM小鼠，雌性，均为8〜10周龄，体重18〜22g，由东南大学医学院实验动物中心提供。试剂环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品

3、；5.氟脲嘧啶为天津金耀氨基酸有限公司产品。实体型荷瘤鼠模型建立无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤细胞超过90%，调细胞浓度为lX107ml_l，分别取接种于KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。实验分组共分4组，每组10只。A组：不作任何处理;B组：接种后第3天开始化疗，•kg-1腹腔注射，连续用药7d;C组［供者淋巴细胞输注组］:接种前lid经脾细胞加CP加供体脾细胞输注的方法［1］诱导对小鼠的特异性免疫耐受状态，接种后第3、10、17天尾静脉注射供鼠脾脏淋巴细胞，细胞数

4、分别为X107、X107及1X107只-1。D组：接种前4d诱导免疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第10、17、24天予DLI，细胞数同C组。观察指标生存时间记录接种当天开始至小鼠死亡的时间，计算各治疗组生命延长率。抑瘤率待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长短径，比较瘤体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑瘤率。肿瘤体积=长径X短径2.2;抑瘤率=.对照组肿瘤体积X100%。瘤体光镜下组织病理学观察接种后第15天各组处死3只小鼠取瘤体，固定包埋切片，HE染色光镜观察。常规无菌取脾，制备脾细胞

5、悬液以备检测。NK细胞杀伤活性检测参照文献［2］的方法略有改动。取上述已制备的脾细胞悬液4X106m1-1，加入96孔培养板，每孔100P1，每只小鼠脾细胞设3个重复孔。取传代48h的H22细胞，调细胞浓度为2X105m1-1，每孔加入lOOul，使每孔效靶比为20:1。平行设效应细胞对照孔。按MTT方法加人试剂并测0D值，依下式计算杀伤率：NKCA=[1-.靶细胞对照孔OD值]X100%o的诱生及其活性检测参照文献[3]T淋巴母细胞增殖分析法。诱生：取上述已制备的脾细胞悬液5X106ml_l放入培养瓶，

6、置37°C、体积分数为的C02培养箱中培养40h，离心收集上清液，置_20°C冰箱保存备用。制备活化的脾淋巴细胞:无菌取正常KM小鼠脾脏，制成5X106ml-l细胞悬液，加入ConA使其终浓度为5mg•L-1，置37°C、体积分数为的C02培养箱中培养48h，收集细胞，离心洗涤2次，配成5X105ml-l细胞悬液作为检测的反应细胞。活性检测：将待测小鼠脾细胞上清液用MTT比色法测定活性。统计学处理所有数据采用SPSS统计软件进行分析，结果以_x±s或百分率表示，两样本均数比较采用t检验。2结果小鼠生存情况

7、各组小鼠100%死亡。A组生存时间d;B、C组生存时间分别为、d，较A组明显延长;D组小鼠平均生存期上升到d，生命延长率％，与其他3组相比大大提高。小鼠肿瘤生长情况接种后第3天即可扪及瘤结节，A组随即迅速增大，C组增大速度稍慢。B、D两组用药后3d内肿瘤逐渐缩小，有些甚至完全消失;B组停药后3d左右肿瘤又逐渐增大;D组肿瘤复发时间延长至7d左右，再次DLI可控制瘤体生长。接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况见表1。表1接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况1）与A组比较，PA、B、C、D各组NK细胞活性依次为土、土

8、、土和土，正常小鼠为土。A组NK细胞活性较正常小鼠明显下降，B组与A组比较差异无显著性，C组NK细胞活性迗正常水平，D组与其余各组比较均有显著差异。的产生及其活性A、B、C、D各组活性依次为土、土、士和士，正常小鼠为士。A组活性明显低于正常小鼠，B组与A组比较差异无显著性，C、D两组活性达正常水平。光镜下瘤体组织病理学变化光镜下各组肿瘤组织均有不同程度的出血、坏死，其中B组纤维化明显，C、D两组瘤组织大片坏死，瘤细胞变小，核固