血浆凝血酶激活的纤溶抑制物elisa定量检测及意义论文

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1、血浆凝血酶激活的纤溶抑制物ELISA定量检测及意义论文李晓娜马德庆王立萍凝血酶激活的纤溶抑制物(Thrombinactivatablefibrinolysisinhibitor,TAFI)是近年来发现存在于血浆中的一种蛋白酶原，属于羧肽酶家族成员1。血液凝固时，TAFI被凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物激活后，可特异性裂解与纤溶酶原有高亲和力结合位点的纤维蛋白羧基末端的赖氨酸残基，从而抑制纤溶酶原的活化，下调纤溶活性。作为凝血与纤溶新的调控因子，TAFI的发现在医学和生物学界引起了很大的兴趣。国外已进行了多项TAFI的研究，

2、研究发现TAFI与多种疾病的病理状态.freelericanDiagnostica公司（批号：873）；RaytoRT-2100C酶标分析仪；罗氏7600全自动生化分析仪及配套试剂。4实验方法4.1血浆TAFIAg水平采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定4.1.1标准曲线的建立血浆标准品制作1∶2，1∶4，1∶10，1∶20稀释。将不同稀释度的参考血浆，每孔加200μl，置37℃中孵育2h；倾倒尽孔中液体，用洗涤缓冲液300μl洗涤5次，甩干，加酶标抗体每孔200μl，置37℃中孵育1h；同上洗涤5次；TMB底物每孔2

3、00μl，室温放置5min，0.45mol/L硫酸溶液，每孔50μl，终止反应。酶标仪选择450nm波长进行读数，以各稀释度的TAFI为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，建立标准曲线。4.1.2待测样品的检测血浆用稀释缓冲液作1∶50稀释，其余操作同标准品，根据标准曲线上的吸光度值可换算出待测样品中TAFI∶Ag的含量。4.2生化指标测定空腹血糖、肝肾功能均在罗氏7600全自动生化分析仪上测定。5数据处理与统计学分析采用SPSS13.0统计软件对所获得的数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用正态分布法估计正常参考

4、值范围。6结果6.1试验方法学评价6.1.1准确度将0.9mL的低值标准血浆加入0.1mL的高值标准血浆TAFI，计算TAFI∶Ag的平均回收率为96.56%。6.1.2灵敏度TAFI∶Ag线性范围为5%～150%；测定结果与TAFI∶Ag的相关系数为0.99219，说明检测结果与TAFI抗原呈良好的线性相关。6.1.3精密度同一份血浆标本批内重复测定10次，TAFI∶Ag的变异系数为3.96%。6.2血浆TAFI∶Ag水平血浆TAFI∶Ag均值为(84.86±19.56)%，以双侧95%的可信区间计算出血浆TAFI∶A

5、g水平的正常参考值范围为45.74%-123.98%。7讨论TAFI是1988年Hendriks等首先用比色法在血清中发现的一种羧基肽酶，由于它的不稳定性，被称为不稳定羧基肽酶(CPU)。1991年Eaton等人从血浆中分离到血浆羧基肽酶原B。1994年CPU被证明是血浆羧基肽酶B。1995年Bajzar1等从血浆中分离出了分子量约为60Kd的单链蛋白质，对其氨基酸测序分析发现该蛋白质与1991年Eaton等分离的血浆羧基肽酶原B为同一物质。至此，对TAFI的研究日益深入。现已清楚TAFI主要由肝脏合成的单链糖蛋白，分子

6、量为60000，含有423个氨基酸残基。TAFI基因定位于染色体13q，完整的TAFI基因全长约48kb，其中有一个约70bp的序列使其能在肝脏内特异性转录。通过Southern印迹分析发现人的TAFI基因存在两种亚型，但两者无功能上的差异。启动子和3′非翻译区存在7个多态性位点，这些多态性位点恰好位于TAFI基因的转录调节区域，从而决定了TAFI的表达水平。编码区存在2个多肽性位点（Ala147Thr，Thr325Ile），后者与TAFI的活性有关3。TAFI在体外激活后对温度高度敏感，在37℃时半减期为15min，在

7、30℃时为45min，在22℃时可延长到数小时，但在-80℃保存14天仍有90%的活性。目前认为活化的TAFI自发性结构改变是此酶活性丧失的主要原因4。由于TAFI的活性极其不稳定，本实验尚未进行TAFI活性的检测。TAFI∶Ag是血栓性疾病新的实验室检测指标，因此测定结果的准确性就显得非常重要。本实验中进行的试验方法学评价证明ELISA结果的可信性，血浆TAFI∶Ag正常参考值与国外文献报道基本一致。我们的检测结果显示正常人群血浆TAFI∶Ag水平有较大差异，可能与TAFI的基因多态性位点有关。参考文献1BajzarL

8、,ManuelR,NesheimME.PurificationandcharacterizationofTAFI,athrombinactivatablefibrinolysisinhibitorJ.JBioChem,1995，270，14477～14484.2Juhan-VagueI,RenucciJF,Grima