葡多酚对体外培养肝细胞pkc表达影响

《葡多酚对体外培养肝细胞pkc表达影响 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、葡多酚对体外培养肝细胞PKC表达影响【摘要】目的体外观察葡多酚(GPC)对小鼠肝细胞蛋白激酶C(PKC)表达的影响。方法将正常小鼠肝细胞加入不同剂量GPC共同培养后，用免疫细胞化学法检测各组肝细胞PKC表达；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测各组肝细胞的增殖活性。结果100mg/LGPC组肝细胞内PKC阳性表达率和细胞增殖活性分别为3424%和0654±0062，经统计学χ2检验和t检验，与正常对照比较差异均有统计学意义(P005)。结论葡多酚可促进小鼠肝细胞PKC表达，提高肝细胞增殖活性。【关键词】葡萄原花青素　　葡多酚，又称葡萄原花青素(grapeprocyanidin

2、s,GPC)，是从葡萄籽中提取的天然多酚类物质。据国内外报道，GPC不仅具有清除自由基、抗氧化等生物学功效，还能促进多种细胞的增殖活性〔1-3〕。本实验采用体外细胞培养，研究不同剂量GPC对小鼠肝细胞PKC蛋白表达的调控作用，探讨其与细胞增殖活性的关系。　　1材料与方法　　11材料　　111GPC样品使用溶剂浸提法从葡萄籽中制取，含量>95%；标准品(日本岛田株式会社)。　　112试验动物山东省实验动物中心提供的昆明小鼠，体重18～20g。　　113主要试剂与仪器一抗小鼠PKC单克隆抗体(简称一抗)(武汉博士德公司)；二抗山羊抗小鼠IgG抗体HRP(简称二抗)

3、(北京中杉金桥公司)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德公司)；PKC一抗工作浓度为1：50；RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；新生牛血清(奥地利PAA公司)；显微镜与照相机(日本OLIMPUS公司)；酶标仪(美国BECKMAN公司)。　　12实验方法　　121肝细胞悬液的制备将新鲜小鼠肝组织剪碎，过100目不锈钢网，3层无菌沙布过滤，1000r/min离心10min，弃上清，加磷酸盐缓冲液(PBS)1000r/min离心10min，制成细胞浓度为1×106、细胞活力>95%的肝细胞悬液备用。　　122PKC蛋白的表达将上述细胞悬液培养于含有

4、10%新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，将盖玻片置于6孔板培养皿中，加入终浓度10，50，100mg/L的GPC，空白对照加入RPMI1640，置37℃、5%CO2培养箱培养24h，取出盖玻片，肝细胞经4%多聚甲醛固定10min。用免疫细胞化学法按检测试剂盒说明检测肝细胞中PKC蛋白的表达〔4〕：10%H2O2灭活内原性过氧化物酶，5%小牛血清蛋白(BSA)封闭液室温20min，加入一抗，二抗(DAB)显色，苏木素-伊红(HE)染色，脱水，透明和封片。高倍(×400)显微镜下观察PKC蛋白的表达水平。选择细胞清晰的视野视察，在每个

5、组观察2500个肝细胞记录其中的阳性细胞数。根据公式：PKC蛋白阳性表达率=PKC阳性细胞数/计数细胞总数×100%计算阳性表达率。　　123MTT法测定各组小鼠肝细胞的增殖活性将肝细胞悬液接种于96孔培养板，每孔01ml，加入终浓度10，50，100mg/LGPC，置37mg/LGPC，置37℃、5%CO2培养箱培养24h，用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法在波长492nm测定细胞增殖活性，用吸光度(A)值表示。根据公式计算GPC对小鼠肝细胞增殖的促进率：促进率(%)=(GPC组-正常对照组)/正常对照组×100%。　　124统计分析采用SPSS110统计软件进行t检验

6、和χ2检验。　　2结果　　21PKC蛋白的表达结果PKC蛋白在细胞内为胞浆表达，光镜下呈现棕黄色颗粒。本实验结果可见，100mg/LGPC组细胞浆内棕黄色颗粒的细胞多、颜色深，为PKC蛋白强表达(图1)，正常对照组胞浆内表达的细胞数少、染色浅，为弱表达(图2)。2组的阳性表达率分别为3424%和1272%经χ2检验，差异有统计学意义(P005)。10，50mg/LGPC组PKC表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P>005)，见表1。　　22增殖活性检测结果100mg/LGPC组的增殖活性分别为(0654±0062)，正常对照组的增殖活性为(0405±0

7、126)，经t检验，两者差异有统计学意义(P005)。10，50mg/LGPC组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>005)，见表2。　　图1高剂量GPC组PKC强表达(DAB×200)（略）　　图2低剂量GPC组PKC弱表达(DAB×2000)（略）　　表1各组PKC蛋白的表达（略）　　注：与正常对照组比较，*P0.05　　表2各组小鼠肝细胞增殖活性（略）　　注：与正常对照组比较，*P005　　3讨论　　本研究显示，100mg/LGPC组PKC蛋白表达水平较正常