葡多酚对体外培养肝细胞pkc表达影响论文

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1、葡多酚对体外培养肝细胞PKC表达影响论文【摘要】目的体外观察葡多酚(GPC)对小鼠肝细胞蛋白激酶C(PKC)表达的影响。方法将正常小鼠肝细胞加入不同剂量GPC共同培养后，用免疫细胞化学法检测各组肝细胞PKC表达；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测各组肝细胞的增殖活性。结果100mg/LGPC组肝细胞内PKC阳性表达率和细胞增殖活性分别为3424%和0654±0062，经统计学χ2检验和t检验，与正常对照比较差异均有统计学意义(P005)。结论葡多酚可促进小鼠肝细胞PKC表达，提高肝细胞增殖活性。【关键词】葡萄原花青素葡多酚，又称

2、葡萄原花青素(grapeprocyanidins,GPC)，是从葡萄籽中提取的天然多酚类物质。据国内外报道，GPC不仅具有清除自由基、抗氧化等生物学功效.freelin离心10min，弃上清，加磷酸盐缓冲液(PBS)1000r/min离心10min，制成细胞浓度为1×106、细胞活力95%的肝细胞悬液备用。122PKC蛋白的表达将上述细胞悬液培养于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，将盖玻片置于6孔板培养皿中，加入终浓度10，50，100mg/L的GPC，空白对照加入RPM

3、I1640，置37℃、5%CO2培养箱培养24h，取出盖玻片，肝细胞经4%多聚甲醛固定10min。用免疫细胞化学法按检测试剂盒说明检测肝细胞中PKC蛋白的表达〔4〕：10%H2O2灭活内原性过氧化物酶，5%小牛血清蛋白(BSA)封闭液室温20min，加入一抗，二抗(DAB)显色，苏木素-伊红(HE)染色，脱水，透明和封片。高倍(×400)显微镜下观察PKC蛋白的表达水平。选择细胞清晰的视野视察，在每个组观察2500个肝细胞记录其中的阳性细胞数。根据公式：PKC蛋白阳性表达率=PKC阳性细胞数/计数细胞总数×100%计算阳性表达率。1

4、23MTT法测定各组小鼠肝细胞的增殖活性将肝细胞悬液接种于96孔培养板，每孔01ml，加入终浓度10，50，100mg/LGPC，置37mg/LGPC，置37℃、5%CO2培养箱培养24h，用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法在波长492nm测定细胞增殖活性，用吸光度(A)值表示。根据公式计算GPC对小鼠肝细胞增殖的促进率：促进率(%)=(GPC组-正常对照组)/正常对照组×100%。124统计分析采用SPSS110统计软件进行t检验和χ2检验。2结果21PKC蛋白的表达结果PKC蛋白在细胞内为胞浆表达，光镜下呈现棕黄色颗粒。本

5、实验结果可见，100mg/LGPC组细胞浆内棕黄色颗粒的细胞多、颜色深，为PKC蛋白强表达(图1)，正常对照组胞浆内表达的细胞数少、染色浅，为弱表达(图2)。2组的阳性表达率分别为3424%和1272%经χ2检验，差异有统计学意义(P005)。10，50mg/LGPC组PKC表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P005)，见表1。22增殖活性检测结果100mg/LGPC组的增殖活性分别为(0654±0062)，正常对照组的增殖活性为(0405±0126)，经t检验，两者差异有统计学意义(P005)。10，50mg

6、/LGPC组与正常对照组比较差异无统计学意义(P005)，见表2。图1高剂量GPC组PKC强表达(DAB×200)（略）图2低剂量GPC组PKC弱表达(DAB×2000)（略）表1各组PKC蛋白的表达（略）注：与正常对照组比较，*P0.05表2各组小鼠肝细胞增殖活性（略）注：与正常对照组比较，*P0053讨论本研究显示，100mg/LGPC组PKC蛋白表达水平较正常对照组显著升高，且呈现随GPC剂量的升高，PKC阳性表达率逐渐升高的明显剂量-反应关系，表明GPC可激活PKC，使PKC蛋白表达水平上升，增强细胞内信息传递与细胞活化的

7、影响，促进细胞的增殖分裂。本研究结果表明，GPC对肝细胞的增殖活性有促进作用，与文献报道GPC可促进细胞增殖活性的结果相一致〔5〕，也同本实验的PKC结果相吻合。综上所述，GPC可提高肝细胞PKC表达水平，对肝细胞增殖活性有促进作用。同时提示，GPC对肝细胞增殖活性的促进作用可能是通过对PKC调控而实现的。【