藤黄菌素体外对重组人蛋白激酶ck2全酶的抑制作用

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1、藤黄菌素体外对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用林小聪，刘新光，陈小文，陈伟珠，梁念慈【关键词】酶动力学InhibitoryeffectofluteolinonrebinanthumanproteinkinaseCK2holoenzymeinvitro　　【Abstract】AIM:ToobservetheinhibitoryeffectofluteolinonrebinanthumanproteinkinaseCK2holoenzymeandtoconfirmtheinhibitorytypebyitsenzymek

2、iicanalysisinvitro.METHODS:RebinanthumanproteinkinaseCK2α＇andβsubunitsixedatequalmolarratiotoreconstituteCK2holoenzyme.Luteolininhibitoryeffectiningtheradioactivityof32Pof〔γ32P〕ATPincorporatedintotheCK2substrateandCK2kiicanalysiseactivityofrebinanthumanproteinki

3、naseCK2ol/L.KiicstudiesofluteolinonrebinanthumanCK2shool/L)andcooperativeol/L).CONCLUSION:LuteolinisaneffectiveinhibitorofproteinkinaseCK2invitro.　　【Keye;luteolin;enzymekiics　　【摘要】目的：观察体外藤黄菌素对重组人蛋白激酶CK2的抑制效果及进行酶动力学分析以确定其抑制作用类型.方法：利用基因工程技术进行克隆、表达和纯化，获得重组人CK2的α＇及β

4、亚基,并在体外等摩尔混合构成CK2全酶.通过测定药物作用后转移到CK2底物上的〔γ32P〕ATP的32P的放射性活度来检测藤黄菌素对酶的抑制作用及采用Lineol/L）.酶动力学分析表明，藤黄菌素与ATP呈竞争性抑制CK2的活性（Ki=0.19μmol/L）,与酪蛋白则呈混合性抑制CK2的活性（Ki=0.11μmol/L）.结论：藤黄菌素是一种较强的体外蛋白激酶CK2的抑制剂.　　【关键词】蛋白激酶CK2；重组蛋白；全酶；藤黄菌素；酶动力学　　0引言　　蛋白激酶CK2全酶是由2个催化亚基(α和/或α＇)及2个调节亚基(

5、β)所组成的异源四聚体，主要有α2β2,α＇2β2或αα＇β23种形式〔1-2〕，具有潜在的致瘤活性并与肿瘤的发生有着密切的联系〔3〕.藤黄菌素(luteolin)可能会影响CK2的活性，因此我们选择藤黄菌素作为研究对象，在已克隆、表达和纯化人CK2α＇及β亚基的基础上〔4-5〕，探讨其对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学，为进一步寻找新型的抗肿瘤和抗病毒药物奠定良好的基础.　　1材料和方法　　1．1材料藤黄菌素为Aldrich公司产品.组蛋白ⅢS，多聚谷氨酸和酪氨酸复合物〔Poly(Glu∶Tyr)4∶1〕

6、，肝素，精胺和ATP购自Sigma公司.5，6二氯1β呋喃糖苯并咪唑(DRB)为Calbiochem公司产品.P81磷酸纤维素滤纸购自an公司.〔γ32P〕ATP为北京福瑞生物医学工程公司生产.　　1．2方法人CK2α＇和β亚基cDNA重组质粒pTCKA＇和pTCKB的克隆与测序见文献〔4〕.重组人CK2α＇和β亚基的原核表达、纯化与鉴定见文献〔4-5〕.蛋白定量：按常规的考马斯亮蓝G250染色法，以牛血清白蛋白作为标准.蛋白激酶CK2的活性测定方法见文献〔6〕.将纯化的重组人CK2α＇与β亚基按等摩尔(14pmol)

7、混合构成重组人CK2全酶.在每个反应管中分别加入不同浓度的藤黄菌素10μL，加入反应混合液15μL，以全酶10μL启动反应观察藤黄菌素对CK2全酶活性的影响.根据半数效量概率单位法〔11〕计算IC50.以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算IC50值(50%抑制时的概率单位为5).根据IC50结果，选择3种浓度的藤黄菌素(0，1，2μmol/L)进行分组.在酪蛋白浓度为2g/L，ATP浓度为10，20，40，80μmol/L情况下测定CK2的活性；或在固

8、定ATP的浓度为10μmol/L，改变酪蛋白浓度(1，2，4，8g/L)条件下测定CK2活性，每个样品同时做3个平行管,采用Line和表观Vmax,以此判断藤黄菌素对CK2抑制作用类型.　　统计学处理：数据用SPSS11.0统计软件处理，实验结果用x±s表示，多组资料采用oneol/L藤黄菌素，其CK2活性占对照组CK2活性的百分