阴沟肠杆菌质粒介导耐喹诺酮类药物的机制研究论文

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1、阴沟肠杆菌质粒介导耐喹诺酮类药物的机制研究论文吴创鸿陆坚邓启文张扣兴【摘要】目的了解深圳地区阴沟肠杆菌中qnrA基因的流行情况、基因定位及其介导喹诺酮耐药性产生的机制。方法收集临床分离的阴沟肠杆菌45株，采用PCR法结合测序的技术筛查qnrA基因，大质粒提取技术、Southern杂交和接合传递试验进行质粒定位，琼脂对倍稀释法进行药物敏感性检测。结果45株阴沟肠杆菌中，7株PCR法及测序证实为qnrA基因。7株菌中6株菌所携质粒被成功提取并进行Southern杂交，qnrA基因定位于80～200kb大小

2、的低拷贝数天然质粒上。4株菌成功进行接合传递试验，使接合子对环丙沙星的MIC值提高了32～64倍。结论质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA在深圳地区阴沟肠杆菌中具有较高的流行率，可能是导致阴沟肠杆菌对喹诺酮类抗菌药获得性耐药的重要原因。【关键词】qnrA基因阴沟肠杆菌喹诺酮耐药质粒PlasmidmediatedquinoloneresistanceinclinicalisolatesABSTRACTObjectiveToinvestigatetheprevalenceandlocationofqnrAg

3、eneinclinicalisolatesofEnterobactercloacaeanditsfunctioninthedevelopmentofquinoloneresistance.MethodFortyfiveEnterobactercloacaeedidextractionandSouthernhybridizationinethelocationofqnrA.Conjugationexperimentsinethetransferabilityanditseffectsinthedeve

4、lopmentofquinoloneresistance.ResultsqnrAatchedthatofNCBIGenBankidextractionandSouthernhybridizationidsinsizeof80～200kb.ConjugationexperimentsidmediatedquinoloneresistanceassociatedShenzhencityandmaycontributetothequinoloneresistanceofthiesebacteria.KEY

5、G252。1.4qnrA序列比较所测序列用DNAstar软件进行序列拼接、校正后，采用美国国家信息中心(NCBI)在线分析工具Blastn(.ncbi.nlm.nih.gov/)程序进行分析，以确定耐药基因型或基因变异情况。qnrA基因参比序列号为AY070235及AY259086。1.5质粒分析及qnrA基因Southern杂交检测QIAfilterPlasmidMaxiKit(QiaGen，德国)提取质粒，0.7%琼脂糖电泳，采用LabImage软件分析与E.coliV517及E.coliJ53/

6、pMG252所携质粒比较的结果，以确定其分子量大小。电泳结果拍照后，用毛细管转移法将质粒DNA转移至硝酸纤维素滤膜上。以切胶纯化的qnrA基因PCR产物为模板制备其检测探针，按地高辛随机引物标记和检测试剂盒(博士德公司，武汉)说明书进行操作。1.6接合传递试验供体菌为临床分离的qnrA阳性株，受体菌为E.coliJ53Azr。将供体菌、受体菌分别接种于LB平板上，35℃过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4ml的LB肉汤中，37℃220r/min摇菌培养8～12ｈ。各取0.5ml供、受体菌于4ml的LB肉

7、汤中，37℃静止过夜培养。接合子以胰大豆琼脂平皿筛选，平皿中含叠氮钠(250μg/ml)及氯霉素(30μg/ml)、庆大霉素(20μg/ml)或四环素(20μg/ml)中的一种。在筛选平皿上生长的菌落同时接种至含及不含环丙沙星(0.06μg/ml)的胰大豆琼脂平皿上，以了解喹诺酮耐药性是否同时转移。此外，以PCR法对筛选出的接合子进行qnrA基因检测，阳性者重新进行菌种鉴定，鉴定为大肠埃希菌者表明携qnrA基因耐药质粒接合转移成功。2结果2.1qnrA基因的检测采用PCR方法对临床分离的45株阴沟肠杆

8、菌进行qnrA基因的筛查，7株(15.6%)得到了阳性扩增条带(Fig.1)。对全部PCR产物进行测序，所得序列采用Blastn程序进行分析，结果显示7个样本的序列均为qnrA基因，与上海王明贵报道的qnrA基因吻合率为100%。qnrA阳性的菌株对环丙沙星的MIC值分别为0.5mg/L3株、2mg/L2株、4mg/L1株，按CLSI折点判断标准分别为敏感、中介和耐药。2.2质粒提取和qnrA基因Southern杂交定位7个qnrA基因阳性株中成功提取了