肝素对小鼠肝癌细胞hcaf和hcap淋巴道转移的抑制作用论文

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1、肝素对小鼠肝癌细胞HcaF和HcaP淋巴道转移的抑制作用论文王宏梅，魏巍，谢涛，康晓慧，左云飞，张嘉宁【摘要】目的观察肝素对小鼠肝癌高转移株HcaF和低转移株HcaP细胞与冰冻淋巴结切片体外粘附和体内淋巴道转移的影响，探讨其作用的分子机制。方法采用细胞黏附检测（Stamperethod）、组织化学、流式细胞分析等方法，观察和检测肿瘤细胞粘附和转移的情况。结果肝素体外对小鼠肝癌细胞HcaF和HcaP与冰冻淋巴结切片粘附有明显的抑制作用.freelg，进口分装，上海生物所）；RPMI1640完全培养液（HyClone公司）；新生小牛血

2、清（中美合资兰州民海生物工程有限公司）；青链霉素（GIBCO/BRL公司）；CFSE（Fluka公司）。CO2恒温细胞培养箱（美国，HEPA公司）；普通显微镜（日本，Olympus公司）；倒置显微镜（日本，Nikon公司）；THZC恒温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂）；流式细胞仪（美国，BD公司）；石蜡切片机（德国）；恒温冷冻切片机（英国）。1.2方法1.2.1细胞培养分别复苏HcaF和HcaP细胞，接种至正常615小鼠腹腔，7天后无菌条件下抽取腹水，再次接种于正常615小鼠腹腔，5天后无菌条件下抽取非血性腹水，以PBS缓冲液洗涤1次，将

3、细胞加入含10％灭活的小牛血清、RPMI1640完全培养液中（含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml），培养24h以使巨噬细胞贴壁，收集悬浮液，离心收集细胞。1.2.2体外粘附抑制实验(Stamperethod)配制终浓度为50U、100U、150U不同肝素浓度细胞悬液（2×105/ml），不加肝素的细胞悬液做对照，37℃温育10min。取正常615小鼠腹股沟、腋窝淋巴结做连续冰冻淋巴结切片（厚7μm），分别加入200μl不同肝素浓度的细胞悬液和对照液，37℃共温育16h，取出后倒去剩余液体，加入生理盐水，轻轻晃动洗涤1次，置于7℃冰

4、箱30min，然后用冷生理盐水震荡洗涤（40r/min，1min）3次，洗去未黏附细胞。95％冷乙醇固定5min，HE染色（苏木素伊红染色，hematoxylineosinstaining），观察细胞粘附部位及数量，随机计数5个低倍视野（100×）并照相保存。实验重复六次。1.2.3体内淋巴道转移抑制试验本实验分对照、100U肝素2组，每组10只小鼠。分别制备HcaF和HcaP细胞悬液（6×107/ml），配制成100U肝素浓度细胞悬液，生理盐水细胞悬液做对照，37℃温育10min。取50μl（3×106个细胞）细胞悬液正常615小鼠足

5、垫注射，以后每隔3天100U肝素组足垫再注射50μl100U肝素溶液,对照组再注射生理盐水50μl。4周后颈椎脱位法处死小鼠，取同侧腘窝、腹股沟、腋窝淋巴结，称其重量，然后4％中性甲醛固定，石蜡切片，HE染色，镜下观测转移发生情况，只要一个部位淋巴结可见肿瘤细胞浸润便确定为发生转移。1.2.4淋巴结归巢实验本实验HcaF和HcaP细胞各分对照、100U肝素2组，每组5只615小鼠。配制100U肝素浓度细胞悬液（2×107/ml），生理盐水细胞悬液做对照，37℃温育10min。然后加入CFSE4（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺脂，终浓度为5μM

6、），37℃温育20min。正常615小鼠足垫注射50μl（1×106个细胞），1h、12h后颈椎脱位法处死小鼠，取同侧腘窝、腹股沟、腋下淋巴结，在0.5ml生理盐水中，剪碎淋巴结，装入Ep管中，加入0.1％胶原酶1μl降解30min，避光保存，尼龙膜筛网过滤，流式细胞仪检测HcaF和HcaP细胞经淋巴道转移到淋巴结的细胞百分率，并显微计数分析。按下列公式计算出转移到淋巴结的肿瘤细胞个数。转移肿瘤细胞数=细胞数/ml×1/2×肿瘤细胞转移百分率1.3统计学分析数据分析采用SPSS10.0统计软件进行检验分析,组间比较采用单因素方差分析法（On

7、eannosereceptorisanovelligandforLselectinandmediateslymphocytebindingtolymphaticendothelium/J/.JExpMed，2001,194(8):10331041./4/QianF,HanahanD,anIL.Lselectincanfacilitatemetastasistolymphnodesinatransgenicmousemodelofcarcinogenesis/J/.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(7):397639

8、81./5/BorsigL,ormetastasiscaninvolvenonmucinligandsandimplicateleukocytesa