anxall调控小鼠肝癌hca-p细胞恶性行为及分子机制研究

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1、中图分类号密级Anxall调控小鼠肝癌Hca．P细胞恶性行为及分子机制研究计：学位论文：51页表格：12个插图：13幅王嘉盛指导教师：孙明忠教授申请学位级别：硕士学位学科(专业)：生物化学与分子生物学培养单位：大连医科大学完成时间：二O一四年五月答辩委员会主席：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研

2、究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：——年一月一日关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“4”)：1．保密口，在一年解密后适用本授权书。2．不保密口。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年

3、月Et大连医科大学硕士学位论文目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6第一部分：Anxall表达稳定下调肝癌Hca-P细胞株的建立(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6(一)日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·(二)材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21第二部分：Anxall对Hca-P细胞恶性行为及分子机制研究(一)材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23(二)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27(三)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33(四)结论⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35(五)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51大连医科大学硕士学位论文Anxall调控小鼠肝癌Hca．P细胞恶性行为及分子机制研究硕士生名字：王嘉盛指导教师：孙明忠教授指导小组：刘淑清教授专业名称：生物化学与分子生物学摘

6、要背景：肝癌细胞淋巴道转移和耐药性是影响肝癌患者预后和生存的重要因素，其相应机制的研究可为其临床诊断和治疗提供依据。膜联蛋白A11(AnnexinAll，Anxal1)为膜联蛋白家族成员之一，是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白。研究表明Anxall表达失调与肿瘤的恶性转变、耐药性及转移等密切相关，但具体作用机制不清。本课题组前期采用Westernblot对来源于同一亲本、遗传背景相同但淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-P(淋巴结转移率约25％)和Hca-F(淋巴结转移率约75％)的研究发现，Anxal1在Hca-

7、P的表达约为其在Hca-F中的2倍(P<0．01)，提示Anxall可能是潜在的抑制小鼠肝癌淋巴道转移的蛋白。目的：1、构建pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Anxal1表达载体，稳定转染至Hca-P，筛选获得Anxall表达稳定下调的Hca-P单克隆细胞株；2、研究Anxall下调对Hca-P体外凋亡、迁移、侵袭、粘附及耐药性的影响；3、探究Anxall下调对Hca-P体内淋巴结转移能力的影响；4、探讨Anxall下调对Hca-P中转录分子c．Jun蛋白以及其磷酸化水平在药物作用前后的变化。方法：1、按Anxall的

8、mRNA序列，设计Anxall的shRNAs以及无关序列作为阴性对照；2、构建含干扰序列的pGPU6／GFP／Neo表达载体，利用限制性内切酶酶切鉴定和序列测定验证构建载体的正确性；3、利用梭华．Sofast转染试剂，将构建好的pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Anxall表达载体及