microrna-150调控肝癌干细胞恶性表型分子机制的研究

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1、重庆医科大学博士学位论文microRNA--150调控肝癌干细胞恶性表型分子机制的研究姓名：张俊申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：李少林201205——一重庆医科大学博士研究生学位论文——————————————————————————————————————————-二———==-．———————一一一．microRNA-150调控肝癌干细胞恶性表型分子机制的．研究中文摘要原发性肝癌为全球常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌的恶性程度高、预后差，肝癌居世界癌症死因的第四位。而我国由于乙型病毒性肝炎的高感染率，肝癌的发病率有增高的趋势。虽然在过去的几十年里肝癌治疗规范的得到了大家共

2、识，但肝癌总的5年生存率总体来讲并不理想，其根本原因可能是由于残余肿瘤细胞对现有治疗手段的抵抗。近年来，肿瘤细胞中的一些特殊亚群具有干细胞特性，称之为肿瘤启始细胞或者肿瘤干细胞(caIlcerstemcells，CSCs)，肿瘤干细胞具有维持和促进肿瘤生长的特性。肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤防治模式提供了全新的思路。根据肿瘤干细胞理论，肿瘤干细胞具有极强的增殖、自我更新和多向分化能力。已有研究表明，肿瘤干细胞可能是肿瘤复发、治疗抵抗的根源。因此，探索肿瘤干细胞在肿瘤发生发展过程中的作用，成为开发靶向肿瘤干细胞的治疗手段的重要研究方向。微RNA(miRNAs)是一类小的内源性非编码单

3、链RNA，长度大约为2l～23个核苷酸，它有负调控靶基因的功能。微RNA既可以起癌基因又可以起抑癌基因的作用。有研究表明，微IⅢA分子通过调控基因和蛋白的表达参与了维持肿瘤干细胞的表型。最近的研究表明，本课题受国家自然科学基金资助，项目批准号：309708433重庆医科大学博士研究生学位论文微RNA在肿瘤的发生、细胞增殖和多向分化等过程中发挥了重要作用。但目前对微IWA在肝癌干细胞中的表达情况仍不清楚。因此，比较肝癌干细胞和非肝癌干细胞之间的微I州A差异表达谱，对于揭示微I斟A对肝癌干细胞恶性表型的调控作用有重要意义。目的：1．通过免疫磁珠法从肝癌细胞系SMMC．7721中分选C

4、Dl33+细胞，并对其肿瘤干细胞特性进行鉴定。2．比较CDl33+SMMC．7721细胞和CDl33‘SMMC．7721细胞之间的差异miRNAs表达谱，并对在CDl33’SMMC．7721细胞中表达显著上调的miRNAs进行生物学信息分析。3．研究调控miRl50对CDl33+肝癌干细胞增殖、分化和侵袭等恶性表型的影响，并揭示其分子机制。方法：1．通过免疫磁珠法分选CDl33+SMMC．7721细胞和CDl33。SMMC-7721细胞，流式细胞仪和W-estembl酣ing检测分选后细胞纯度。2．CCK一8法检测CDl33+SMMC．7721细胞增殖能力，克隆形成实验检测CDl

5、33+SMMC．7721细胞克隆形成能力，无血清成球实验检测CDl33+SMMC-7721细胞单克隆细胞团形成能力，NOD／SCID老鼠移植瘤实验检测CDl33+SMMC．7721细胞成瘤能力。3．利用Thzol法分别抽提CDl33+SMMC．7721细胞和CDl33。SMMC-772l细胞的总RNA，miIⅢA基因芯片检测两组细胞miRNAs差异表达谱，荧光定量PCR对感兴趣的差异miIⅢAs进行验4重庆医科大学博士研究生学位论文证。利用三种常用的生物信息学软件(miRanda、TargetSCANandPicTaur)对表达差异显著的miRNAs进行生物信息学分析及靶基因预测

6、。4．构建miR．150慢病毒表达载体并转染CDl33+SMMC．7721细胞andCDl33。SMMC．7721细胞。通过转染miR．150慢病毒过表达载体后，检测其对CDl33+SMMC．7721细胞增殖和自我更新潜能的影响，包括细胞增殖能力、无血清成球能力、细胞周期、凋亡和细胞侵袭能力。双荧光素报告基因验证miR一150及其预测靶基因c-Myb的调控关系。结果：1、SMMC．7721细胞系中CDl33+细胞表达比例约为O．20％到2．16％，免疫磁珠分选后CDl33+细胞表达比例约为92．05土5．12％。W-estemblotting结果显示CDl33蛋白在CDl33+S

7、MMC-7721细胞和CDl33。SMMC．7721细胞中表达水平有显著性差异(O．873士0．05vs．0．067土0．015)。2、分选得到的CDl33+SMMC．7721细胞置于含生长因子的无血清条件培养基中培养24～72h后即可形成细胞球，而CDl33。SMMC一7721细胞则不能形成细胞球。当将CDl33+SMMC．7721细胞培养形成的细胞球转移到含血清的培养基后，细胞球开始贴壁生长，而且48h内细胞球就会全部贴壁。3、CDl33+SMMC．772l细胞的增殖能力明显