anxa3表达上调对小鼠肝癌hca-p细胞株生物学行为影响

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1、独创性声明ll燃必必剃本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：—垡罐签字日期：兰年』月旦日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯

2、⋯⋯⋯OOOOOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOOODOOOOOOO⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)刚舌””一”⋯““”“一”一””一””一””一”⋯⋯”⋯一“”一“”。5(二)第一部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(三)第二部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ODOO⋯⋯⋯OOO⋯⋯⋯17(四)第三部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37(

3、一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯000⋯OOQO⋯⋯⋯⋯⋯43四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOOOOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46Anxa3表达上调对小鼠肝癌Hca-P细胞株生物学行为的影响硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：徐康刘淑清副教授孙明忠教授生物化学与分子生物学摘要目的：恶性肿瘤严重威胁人类健康，而淋巴道转移是上皮来源恶性肿瘤细胞的早期主要转移方式，并直接导致了肿瘤患者的死亡率高、预后差，但是恶性肿瘤的淋巴道转移发生机制至今仍不清。目前肿瘤转移的细胞模型被视为研究肿瘤转移分子机制的可靠途径。

4、AmXa3(膜联蛋白A3，AnnexinA3)是我们前期采用定量蛋白质组学及生物信息学方法，筛选出的一个可能促进肝癌淋巴道转移关键性因子。但目前—恤a3与肿瘤淋巴道转移明确关系研究鲜有报道。本论文以Anxa3为研究对象，试图构建pEGFP-N1．—6似a3表达载体稳定转染Hca．P细胞获得Anxa3表达水平上调的Hca．P细胞株，探究A【lXa3表达水平上调对小鼠肝癌低淋巴道转移力细胞株Hca．P增殖、侵袭、迁移和淋巴道转移能力的影响，以此对肿瘤淋巴道转移机制研究提供一定实验基础数据。方法：1．采用RT．PCR方法获得Anxa3CDS，将纯化后的PCR产物加A尾，与P

5、MD18．T进行T．A克隆，得到T．加1xa3克隆质粒，进行PCR、单双酶切及测序鉴定。将T．Anxa3和pEGFP．N1空质粒分别进行SalI和BamHI双酶切，纯化并连接，获得pEGFP-NI．An)【a3表达质粒，并进行PCR鉴定及单双酶切鉴定。在确定pEGFP．N1．p心a3载体构建成功后，行测序鉴定。2．采用So．st转染试剂分别将pEGFpoNl．～Ⅸa3环状质粒及线性化质粒转染Hca．P细胞，转染24h后用含400pgmlG418的15％胎牛血清的RPMI．1640培养基进行筛选。3．转染后用有限稀释法筛选单克隆细胞，观察其形态变化，采用Real．tim

6、ePCR和Westernblot分别检测Anxa3在mRNA和蛋白水平的表达水平。以三组细胞(Hca．P细胞，转染pEGFP．N1空质粒的阴性对照，单克隆细胞Hca．P。∞)为实验对象，1)采用CCK．8法检测Anxa3表达上调对Hca．P细胞增殖能力的影响；2)Transwell小室法分析Anxa3表达上调对Hca．P细胞侵袭和迁移能力的影响；3)采用小鼠足垫种植方法分析Anxa3表达上调对Hca．P细胞株体内成瘤及淋巴结转移潜能的影响。结果：1．成功构建T．Anxa3克隆载体和pEGFP．N1．Anxa3真核表达载体，经测序鉴定，所得到载体中Artxa3的CDS序

7、列无误。2．获得单克隆细胞株Hca．P。∞，1)Real—TimePCR结果显示：与Hca．P细胞相比，单克隆细胞株Hca．P。。0中Anxa3在mRNA水平表达上调1．7倍；2)Westernblot结果显示单克隆细胞株Hca．Pn。。中Anxa3在蛋白水平上表达上调1．6倍；3)CCK．8检测结果显示Anxa3表达上调对Hca．P细胞增殖能力无明显影响；4)Anxa3表达上调促进Hca—P细胞侵袭和迁移能力；5)体内淋巴结转移实验显示，Anxa3表达上调组小鼠足垫接种后原发部位肿瘤溃烂明显，淋巴结转移率高于对照组。结论：1．T-Anxa3克隆质粒