转染抑癌基因pten对人乳腺癌zr751细胞的细胞周期和增殖能力的影响论文

《转染抑癌基因pten对人乳腺癌zr751细胞的细胞周期和增殖能力的影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、转染抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR751细胞的细胞周期和增殖能力的影响论文李祥勇，林观平，周克元【关键词】人乳腺癌ZR【摘要】目的：观察PTEN（phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen，第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因）对人乳腺癌细胞ZR751细胞增殖和细胞周期的影响。方法：利用脂质体介导法将携带有野生型和突变型PTENcDNA的真核表达载体pBPRNA及PTEN蛋白出现明显的高表达。Cethods:Theeukaryoticexpressionve

2、ctorpBPine.ThreegroupserasechainreactionandTTandfloetry.Results:HighexpressionofPTENmRNAandproteinG1toSofCTT法和流式细胞术检测转染后PTEN基因对ZR751细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，以探讨其在乳腺癌细胞株生长抑制过程中的作用机制。1材料与方法1．1材料人乳腺癌细胞株ZR751由中国医学科学院基础医学研究所提供。pBPa公司。RTPCR反应试剂盒购自QIAGEN公司。小鼠抗人PTEN单克隆抗体、山羊抗人Actin多

3、克隆抗体、EXL发光试剂盒购自SantaCruz生物技术公司。HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记马抗山羊IgG等其它试剂购自北京中山生物技术有限公司等国内公司。PTEN、GAPDH引物由上海生工公司合成。1．2方法1.2.1细胞培养ZR751细胞培养于含体积分数为15%胎牛血清，100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640完全培养液中，同时细胞培养液加入0.5U/mL胰岛素，并将细胞于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度孵箱中培养，经过消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。1.2.2质粒转染按照Lipof

4、ectamine2000说明书分别将编码人野生型PTEN的真核表达质粒pBPg/L嘌呤霉素持续筛选3周，挑选阳性细胞克隆，扩增培养。分别将成功转染pBPRNA的表达，利用引物合成软件Premier5和oligo6自我设计PTEN（373bp）引物序列为：PTEN/senseprimer:5’aaagctggaaagggacgaac3’；PTEN/antisenseprimer:5’caggtaacggctgagggaac3’；GAPDH/senseprimer:5’gaaggtgaaggtcggagtc3’；GAPDH/an

5、tisenseprimer:5’gaagatggtgatgggatttc3’。RTPCR反应体系：50℃30min(RT反应)，95℃15min（预变性），94℃45sec（变性），55℃1min（退火），72℃1min（延伸），共30个循环，72℃10min（后延伸）；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，图像分析软件BandScan4.3进行光密度积分值分析，计算出PTENmRNA与内参照GAPDHmRNA的光密度积分值比作为PTENmRNA的相对含量值。1.2.4TT法检测不同PTEN表达质粒对细胞的增殖况分别

6、取CI1640培养中培养48h后，加入10mg/mLMTT10μL，继续培养4h，在加入100μL/孔的DMSO，取出后，用酶标仪测定吸光度A570nm，结果取3个平行孔的均值，重复3次实验。肿瘤细胞的存活率（%）=（各组A570nm/阴性对照组A570nm）×100%。细胞抑制率（%）=1（各组A570nm/阴性对照组A570nm）×100%。1.2.6流式细胞术分别取C（floetry，流式细胞术）检测。1.2.7统计学处理实验计量资料用±s表示，使用SAS8.0统计软件进行统计描述。行单因素方差分析和q检验，两组抑制率

7、比较行t检验。2结果2.1PTEN基因成功转染采用脂质体介导法，将质粒pBPRNA的表达水平紫外灯下可见，C：100bpDNAmarker;A:ZR751细胞；B：CG129RPTEN细胞；C：CITHJS，SATOK，etal.InvestigationofgermlinePTEN,p53,p16(INK4A)/p14(ARF),andCDK4alterationsinfamilialglioma［J］.AmJMedGe,2000,92(2):136141.［5］LIJ，YENC，LIAutatedinhumanbrain

8、，breast,andprostatecancer［J］.Science，1997,275(5308):19431947.［6］DEGRAFFENRIEDLA，FULCHERL，FRIEDRICHSplificationcontributestocisplatinresistanceina