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1、VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响论文.freelanbreastcancercellsAbstractAIM:ToexploretheeffectofRNAinterferencemediatedvascularendothelialgroanbreastcancerMCF7cells.METHODS:SmallinterferingRNA(siRNA)targetingVEGFgeneplateine,theproliferationofMCF7cellsetry,andtheapoptosiseasuredb
2、yHoechst33258staining.Thechangeofcellcycleetry(FCM).TheexpressionofVEGFonmRNAandproteinlevelmunohistochemicaltechnologyrespectively.RESULTS:ThesiRNAtargetinghumanVEGFgeneeffectivelyinhibitedtheproliferationofMCF7cells,inducedcellapoptosis,arrestedthecellcycleinG0/G1phase,and
3、decreasedtheexpressionofVEGFonbothmRNAandproteinlevel.ButtheseeffectsdidnotappearinscrambledsiRNA(siRNASCR)controlgroup.CONCLUSION:ThesiRNAtargetinghumanVEGFgenecouldreduceVEGFexpression,.freelRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果:所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G
4、1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论:体外转录合成的siRNA可抑制MCF7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。关键词RNA干扰;小干扰RNA;MCF7细胞;血管内皮生长因子;基因治疗将外源性或内源性双链RNA(dsRNA)导入细胞后,可引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解,其相应的基因也受到抑制,这种发生在转录后的基因静寂(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)现象1,2被称之为RNA干扰(RNAinterf
5、erence,RNAi)。各种体内外实验证实,21～23个碱基的短双链RNAsiRNA可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用,并且比用核酶或反义RNA更有效、更彻底。siRNA的干预效应具有高度的序列特异性,任一碱基的错误均会导致RNAi效应的丧失3。20世纪70年代初,Folkman4首先提出“肿瘤生长和转移都依赖于新生血管的形成”的概念,并得到大量实验结果的证实。目前发现,能刺激细胞运动和肿瘤血管生成的因子有20多种,其中血管内皮生长因子(vascularendothelialgroineTM2000及TRIzolReagent购自Invi
6、trogen公司。T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem试剂盒和反转录试剂盒购自Promega公司。四唑氮蓝（MTT）购自Sigma公司。Hoechst33258购自碧云天生物公司。SP法检测试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。1.2方法1.2.1siRNA的制备从GenBank中获得已知的人VEGFmRNA的序列(序列号:AB021221),用Promega公司提供的设计软件和试剂盒设计合成siRNA的序列。错义序列组SCR的序列跟第2组siRNA的序列有相同的GC组成,但与人的mRNA没有明显的同源性,以此作为阴性对照6。
7、体外转录出siRNA,并分别标记为siRNA1、siRNA2和siRNASCR。3种siRNA的序列分别为:5′GAUCAAACCUCACCAAGGCUU3′(正义链),5′GCCUUGGUGAGGUUUGAUCUU3′(反义链);5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCUU3′(正义链),5′GAUCUCAUCAGGGUACUCCUU3′(反义链);5′GCGUAACGCGGGAAUUUACUU3′(正义链),5′GUAAAUUCCCGCGUUACGCUU3′(反义链)。1.2.2MCF7细胞增殖的MTT比色法检测取对数生长期的MCF7细胞
8、,调整细胞的密度为6×107个/L加入到96孔板内,每孔100μL,于37℃、50mL/LCO2饱和湿度的培养箱中培养。培养24h后弃去上清,以脂质体
