采取改良sds法对天麻花葶dna提取研究

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1、采取改良SDS法对天麻花葶DNA提取研究关键词：天麻；基因组DNA；DNA提取采取改良SDS法对天麻花葶DNA提取研究*【摘要】以天麻花葶为材料，采用改良SDS法对天麻DNA提取进行了研究，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测，能得到高纯度的DNA，OD260/OD280在1.75～1.9之间，蛋白质、多糖、RNA等去除较彻底，适于进一步分析。【关键词】天麻；基因组DNA；DNA提取StudyonextractionofDNAofGastrodiaelata.scapeinanimprovedSDSmethod【Abst

2、ract】TheDNAofGastrodiaelata.scapeprovedSDSmethod.TheextractedDNAinedbyultravioletabsorptiontestandagarosegelelectrophoresis.TheresultsshoprovedSDSmethodinatedpletely.Itcouldbeusedforanalysis.【KeyeDNA；DNAextracting从药材天麻花葶中提取到高质量的DNA，是成功构建DNA指纹图谱的前提。有效去除DNA所含的杂质(糖类

3、、酚类等)，避免多糖、多酚、色素等影响DNA聚合酶的活性是获取高质量DNA的关键。近来植物总DNA提取的方法主要有两种：CTAB法和SDS法。由于本实验所选材料为新鲜天麻幼嫩的花葶，一是避免DNA分子发生降解，二是天麻花葶为新鲜幼嫩部分，为其生长点DNA含量高且次生代谢产物少，避免多糖及酚类杂质影响DNA的纯度和产率。故选用了操作简单、性质温和的改良的SDS法提取天麻基因组DNA。1材料与方法1.1仪器材料DYY-8B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)、JUNYI电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像仪(Biorad公司

4、)、SmartspecTM3000DNA浓度的测定仪(Biorad公司)。“S”提取液、TE缓冲液、苯酚：氯仿(1∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)、氯仿、异丙醇、3mmol/LNaAc10mg/mlRNaseA。植物材料为兰科天麻(GastrodiaelataBlume.)新鲜花葶。以野生型天麻和种植型天麻为实验对象，编号分别为1、2、3、4、5(其中1、2为大方GAP栽培品乌天麻，3、4、5为野生品乌天麻)，由贵阳医学院王晓丽教授鉴定、提供。1.2方法1.2.1天麻基因组DNA提取本研究在EdlEppendorf管中，

5、迅速加入预热至65℃的“S”提取液750μl，经摇充分混匀，在65℃水浴中保温1～2h，其间颠倒混匀数次，取出，10000r/min离心10min；(3)加等体积的苯酚：氯仿(1∶1)，轻轻摇匀，10000r/min离心10min，转移上清液；(4)加等体积的氯仿溶液，混匀后，10000r/min离心10min，转移上清液；(5)加0.6倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，于-20℃静置30min；(6)用枪头小心挑出絮状DNA，加150μl的70%乙醇冲洗2次；勾出的DNA，在通风橱中风干，加100～150μl1×TE，溶解

6、；(7)加3～4μlRNaseA，37℃放置1～2h，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的去除情况，再加500μl1×TE缓冲液；重复(3)(4)过程，将(3)中的苯酚：氯仿(1∶1)用氯仿：异戊醇(24∶1)取代：取上清液加入1/10体积3MNaAc，混匀后，加入2倍体积的冰冻乙醇，于-20℃静置20min，沉淀DNA；加150μl70%乙醇洗脱2次，勾出的DNA，室温风干；加50～300μl1×TE溶液溶解DNA，4℃下保存。1.2.2DNA的质量检测用0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙啶)染色，进行DNA质量检测，电泳缓

7、解液为1×TAE，电压为80V，电泳1～2h，然后在紫外凝胶成像系统下观察摄像。1.2.3DNA的浓度检测取2μlDNA溶液用1×TE稀释100倍，在核酸分析仪上，测定在260nm/280nm波长下的吸收值，根据A260/A280判断DNA纯度，A280值计算DNA产率。并计算OD值(A260/A280)，调整所有DNA的量至200～500ng/μl左右。2结果与分析本试验采用SDS法提取天麻基因组DNA，SDS法操作简单，温和，可提取到较高分子量DNA，经DNA的质量检测显示，其分子量太小约23.2kb，点样孔不发亮，

8、DNA主带清晰，无弥散带，无明显的RNA带，说明天麻的RNA、蛋白质、多糖以及其他次生代谢物质去除的比较干净，纯度较高(见图1)。经DNA的浓度测定显示DNA浓度在3.0mg/g以上，A260/A280值均在1.75以上(见表1)，说明质量较高。图1天麻DNA琼脂糖凝胶电泳结果表1DNA样品的浓度测定结果.L.编辑。