改良CTAB法提取草莓基因组DNA.pdf

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1、2014年第6期现代园艺改良CTAB法提取草莓基因组DNA张璐璐-，樊晨，樊哲，高庆玉(1西安职业技术学院生物工程系，陕西西安710077；2东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨150030)摘要：草莓中多糖多酚含量丰富，同DNA结合生成凝胶状物，使其无法用于后期研究，恰当的草莓DNA提取方法一直未能找到。在前人工作基础上，改进了提取植物DNA的CTAB法，得到的草莓基因组DNA纯度较高，可用于后期实验所需。关熊词：草莓；基因组DNA；改良CTAB法；PCK草莓是一种多年生草本植物，属于蔷薇科草莓属，醇、异丙醇、70％乙醇、

2、无水乙醇、醋酸钠、氯化钠、盐是世界上温带地区的一种重要水果，它营养丰富，产量酸、氢氧化钠、冰乙酸、硼酸均购自大连宝(TaKaRa)生高，用途广泛，具有重要经济价值。草莓富含多糖多酚，物工程公司，琼脂糖、10×LoadingBufer、DL2000DNA多酚是一种很强的氧化因子并能够不可逆地同DNAMarker均为Takara公司产品。结合，生成褐色的凝胶状物；高水平的多糖也可以使仪器设备：电子天平、微波炉、冰箱、蒸馏水器、研DNA形成粘性沉淀而难以处理【l】。这些化合物在高浓钵和研杵、烧杯、电热恒温水浴锅、核酸电泳槽、稳压

3、稳度时，还会抑制限制性内切酶和DNA聚合酶，使得提流电泳仪、紫外可见分光光度计、紫外切胶仪、高压蒸取的DNA无法用于包括AFLP、RAPD分析，PCR和基汽灭菌锅、离心管、Eppendorf移液枪、吸头。因克隆等研究中。对于许多植物来说，用简单的碱裂解2试验方法法就可以制备得到足够量的用于扩增的叶片DNA，而2．1DNA的提取采用2种方法分别进行恰当地提取草莓DNA的方法一直未能找到，因此解决2．1．1采用原始CTAB法翻(小量提取)：a．取10—100mg这一问题对后期检测工作显得尤为重要。因此，本课题的叶片，于液氮中研

4、磨成粉．b．将冻粉转入预冷的离心组在前人工作基础上，对草莓基因组DNA的提取方法管中，立即加入0．7ml(w／v)65oC预热的2XCTAB提取进行了优化和对比分析，以期为以后的工作奠定基础。缓冲液，充分混匀，65℃保温30～40min，其间不时摇1试验材料动；c．加入等体积的氯仿，异戊醇(24：1)，轻缓颠倒离试验选用黑龙江省草莓主栽品种森嘎拉和戈雷拉心管混匀，室温下12000rpm离心10min；d．将上清液作为试验材料，材料来源于东北农业大学园艺试验站转入另一个离心管中，加入1／10体积的10％CTAB混果园。匀，加

5、入等体积的氯仿，异戊醇，颠倒离心管混匀，室液氮、CTAB、Tris、EDTA、2一巯基乙醇、氯仿、异戊温下12000rpm离心10min；e．重复操作1次；￡将上清2．7加标回收率实验本文建立了苹果、青椒、西红柿和茄子中绿原酸的分别准确取4份茄子各15g，各加入80％乙醇溶HPLC测定方法，采用乙腈和磷酸缓冲液(0．5％)进行洗液20mL，分别在组织匀浆机中捣碎匀浆后置50mL容脱，绿原酸在12min内得到了很好的分离，采用330nm量瓶中，在其中的3份中分别加入不同量的绿原酸标波长进行检测，使绿原酸有较强吸收，从而降低了

6、检测准溶液，加80％乙醇溶液至刻度，摇匀，超声20min，过限。定量分析结果表明，该方法精密度好、回收率高。滤，取滤液，用微孔滤膜(0．45rfi)过滤，取其滤液，作(收稿：2014—02_25)为供试品溶液。然后按1I2的色谱条件测定1．3配制好参考文献【1】孙健．吴国娟．绿原酸的研究进展卟中兽医学杂志，2009，1．的供试样品溶液，实验结果见表2。[2】张英锋，张立艳，马子川，等．植物绿原酸的研究进展卟化学教育，表2绿原酸回收实验结果2011．4：1-4．f31李利华．高效液相色谱法测定黄瓜皮中绿原酸含量卟氨基酸和生物

7、资源，2011．33(2)：76-75．f41崔伟伟，范永春．不同提取方法测定野马追药材中绿原酸含量比较研究m．辽宁中医药大学学报，2011，13(3)：178-179．【51袁华，邓良，孙炎彬，等．可见分光光度法测定杜仲叶中的绿原酸U1．生物加工过程，2007，5(1)：71—73．【6】张风云，毛富春．用毛细管区带电泳技术测定杜仲叶中绿原酸含量的研分析测试学报，1996，15(3)：66—68．【71朱玉，张书胜，张西林，等．薄层色谱法分析葵花仁粕中的绿原酸由表2可见，回收率在98．57％～101．o6％之间，平Ⅱ】．

8、色谱，2001，19(1)：82—83均回收率为99．52％。『8]g晋梅，罗玉柱，曹禄兴，张咏梅，刘秀．高效液相色谱法同时测定沙3结论枣果实中5种酚类化合物Ⅱ1_食品工业科技，2011,8：392—393．⑤现代园艺2014年第6期液转入另一个离心管中，加入l倍体积的异丙醇，室温260／OD280大于