CTAB法小量提取植物基因组DNA.doc

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1、CTAB法小量提取植物基因组DNA【实验目的】1．理解植物基因组DNA提取的原理。2．掌握CTAB法从植物组织中提取DNA的方法。【实验原理】CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，在低离子强度溶液中可以沉淀核酸与酸性多聚糖，而在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而此条件下DNA呈可溶状态.。在本实验中利用CTAB破坏细胞膜，使DNA释放出来。在高盐溶液中CTAB与蛋白质和多糖形

2、成复合物后，再通过有机溶剂抽提去除蛋白、多糖、酚类等杂质，最后加入异丙醇即可使DNA分离出来。【器材、试剂与材料】1．器材研钵、水浴锅、高速台式离心机、微量移液器、恒温箱、水平式琼脂糖凝胶电泳系统、1.5mLEppendorf管、Tip头。2．试剂(1)CTAB提取液含终浓度为100mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(pH8.0)，2%(m/V)CTAB和0.2%巯基乙醇(用前加入)溶液。(2)氯仿/异戊醇参见实验1。(3)异丙醇(4)70%(V/V)乙

3、醇(5)RNaseA(10mg/mL)参见实验1。(6)限制性内切酶(7)琼脂糖(8)50×TAE参见实验4。(9)溴化乙锭(EB)母液参见实验4。【实验步骤】1．将新鲜豌豆叶片放入经液氮预冷的研钵中，研磨，尽量细。2．取少许材料加入1.5mL离心管中，加入600μL65℃预热的CTAB提取液，快速混匀。3．65℃保温30min，不时颠倒混匀。4．待冷至室温后加入500μL氯仿/异戊醇(V1:V2=24：1)，颠倒混匀使溶液呈乳浊状(不要振荡)，以12,000r/min的转速，离心5min。5．取上清液，加入6

4、00μL预冷的异丙醇，颠倒混匀。6．以12,000r/min的转速，离心10min，沉淀DNA，弃去上清液。依次用800μL70%(V/V)乙醇洗涤沉淀两次。7．稍干燥，将DNA沉淀溶解于30μL灭菌的双蒸水（含RNaseA），37℃保温30min消化RNA，4℃保存。8．取10μg基因组DNA，用10U特定限制性内切酶，37℃消化8-12h。9.在0.7%(m/V)的琼脂糖凝胶上稳压电泳，检测基因组DNA及酶切情况。【要点提示】1．CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须

5、预热，且离心时温度不要低于15℃。2．因为基因组DNA一般比较大，为防止DNA因机械剪切而断裂，应避免剧烈振荡或小孔Tip头快速抽吸溶液中的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到DNA分子长度达50-100kb。3．不同的植物所含的主要杂质也不一样(如有些植物酚类物质含量较高，有的糖类含量较高)，要根据不同植物的特性选择不同的基因组DNA提取方法。