采取改良sds法对天麻花葶dna提取研究论文

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1、采取改良SDS法对天麻花葶DNA提取研究论文.freelprovedSDSmethod【Abstract】TheDNAofGastrodiaelata.scapeprovedSDSmethod.TheextractedDNAinedbyultravioletabsorptiontestandagarosegelelectrophoresis.TheresultsshoprovedSDSmethodinatedpletely.Itcouldbeusedforanalysis.【KeyeDNA；DNAex

2、tracting从药材天麻花葶中提取到高质量的DNA.freelartspecTM3000DNA浓度的测定仪(Biorad公司)。“S”提取液、TE缓冲液、苯酚：氯仿(1∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)、氯仿、异丙醇、3mmol/LNaAc10mg/mlRNaseA。植物材料为兰科天麻(GastrodiaelataBlume.)新鲜花葶。以野生型天麻和种植型天麻为实验对象，编号分别为1、2、3、4、5(其中1、2为大方GAP栽培品乌天麻，3、4、5为野生品乌天麻)，由贵阳医学院王晓丽教授鉴定、提供。1

3、.2方法1.2.1天麻基因组DNA提取本研究在EdlEppendorf管中，迅速加入预热至65℃的“S”提取液750μl，经摇充分混匀，在65℃水浴中保温1～2h，其间颠倒混匀数次，取出，10000r/min离心10min；(3)加等体积的苯酚：氯仿(1∶1)，轻轻摇匀，10000r/min离心10min，转移上清液；(4)加等体积的氯仿溶液，混匀后，10000r/min离心10min，转移上清液；(5)加0.6倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，于-20℃静置30min；(6)用枪头小心挑出絮状DNA，加

4、150μl的70%乙醇冲洗2次；勾出的DNA，在通风橱中风干，加100～150μl1×TE，溶解；(7)加3～4μlRNaseA，37℃放置1～2h，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的去除情况，再加500μl1×TE缓冲液；重复(3)(4)过程，将(3)中的苯酚：氯仿(1∶1)用氯仿：异戊醇(24∶1)取代：取上清液加入1/10体积3MNaAc，混匀后，加入2倍体积的冰冻乙醇，于-20℃静置20min，沉淀DNA；加150μl70%乙醇洗脱2次，勾出的DNA，室温风干；加50～300μl1×TE溶液溶解DN

5、A，4℃下保存。1.2.2DNA的质量检测用0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙啶)染色，进行DNA质量检测，电泳缓解液为1×TAE，电压为80V，电泳1～2h，然后在紫外凝胶成像系统下观察摄像。1.2.3DNA的浓度检测取2μlDNA溶液用1×TE稀释100倍，在核酸分析仪上，测定在260nm/280nm波长下的吸收值，根据A260/A280判断DNA纯度，A280值计算DNA产率。并计算OD值(A260/A280)，调整所有DNA的量至200～500ng/μl左右。2结果与分析本试验采用SDS法提

6、取天麻基因组DNA，SDS法操作简单，温和，可提取到较高分子量DNA，经DNA的质量检测显示，其分子量太小约23.2kb，点样孔不发亮，DNA主带清晰，无弥散带，无明显的RNA带，说明天麻的RNA、蛋白质、多糖以及其他次生代谢物质去除的比较干净，纯度较高(见图1)。经DNA的浓度测定显示DNA浓度在3.0mg/g以上，A260/A280值均在1.75以上(见表1)，说明质量较高。图1天麻DNA琼脂糖凝胶电泳结果表1DNA样品的浓度测定结果3讨论3.1天麻块茎含有大量的糖类、酚类以及蛋白质等物质，如果选

7、用干品药材，由于老化和贮存时间较长，植物材料中多糖和酚类含量较高，从中提取得到的DNA，常会和多糖、酚类形成共沉淀而成胶冻状或黄褐色，严重影响了DNA的得率和质量。在天麻生活史中，大部分阶段都与蜜环菌共生，因此选择适当的阶段和部位对DNA的提取也很重要。由于初生块茎的皮层细胞内有蜜环菌，故用初生块茎提取DNA时，要去除蜜环菌，最好取生长点部位的组织，这样既可避免蜜环菌DNA污染，又可得到产量较高的DNA。新鲜和幼嫩的植物材料因其含有较完整的DNA，从天麻花葶的幼嫩部分提取DNA是最理想的部位。一方面花

8、葶没有蜜环菌侵染，同时花葶又是形成花和花序的生长点部分，细胞中含有丰富的DNA。从该部分提取DNA，通常能获得产量高、质量好的DNA。但从花葶提取DNA，因受天麻生长季节的限制，通常只有当天麻开花时才能取材。3.2从不同的植物材料中获得基因组DNA只是在得率和纯度以及对后续反应的影响等方面有所差异，但因各方法本身具有不同的特点和优势，故针对不同的植物材料或同一样本的不同部位，应选择最适合的方法来应用［4～6］。本实验采用改良的SDS法提取天麻基因组总DN