改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验.doc

《改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验　　摘要：由于大戟属植物叶片中含大量的多糖、酚类等次生代谢物质，严重影响总ＤＮＡ的提取，因此，以大戟属药用植物叶片为材料，对常用的ＣＴＡＢ法进行了改良，并通过琼脂凝胶电泳法对所提ＤＮＡ样品进行了检测。结果表明，改良ＣＴＡＢ法提取的植物总ＤＮＡ纯度很高，较适合提取大戟属植物的总ＤＮＡ。　　关键词：大戟属；药用植物；ＣＴＡＢ法；总ＤＮＡ提取　　中图分类号：Ｑ９４９．７５３．５；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11416－3418-03　　　　ＡＭｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢＭｅｔｈｏｄｆｏｒＴｏｔａｌＤＮ

2、ＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅＭｅｄｉｃｉｎａｌＨｅｒｂＬｅａｖｅｓｏｆＥｕｐｈｏｒｂｉａLinn　　　　ＷＥＩＳｈｅｎｇ－ｈｕａ，ＭＥＮＧＮａ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃｅｌｌｓinＥｕｐｈｏｒｂｉａＬｉｎｎｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｒｉｃｈｉｎａｍｙｌｏｓｅａｎｄｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ．ＴｈｅｓｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓprovidedsomeｓｅｒｉｏｕｓｌｙａｄｖｅｒｓｅｅｆｆｅｃｔsoｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒｏｍＥｕｐｈｏｒｂｉａ．ＵｓｉｎｇｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆＥｕｐｈｏｒｂｉａａｓｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅＤＮＡｗｅｒ

3、ｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙａｍｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｍｅａｎsｏｆａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄｗａｓsuitableｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎofits’ＤＮＡａｎｄｉｔｗａｓａｇｏｏｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｏｔａｌＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＥｕｐｈｏｒｂｉａ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｕｐｈｏｒｂｉａＬｉｎｎ；ｍｅｄｉｃｉｎａｌｈｅｒｂ；hｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅｍｅｔｈ

4、ｏｄ；ｔｏｔａｌＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　　　　ＤＮＡ的提取与纯化是进行分子标记试验最关键的一步，获得高质量的ＤＮＡ样品是进行ＰＣＲ扩增的首要步骤［１］。从植物材料中提取基因组ＤＮＡ的质量受到多种因素的影响，在不同植物或同种植物不同时期组织中存在着不同数量的多糖、色素以及种类繁多的次生物质，特别是多糖、酚类在提取过程中可与ＤＮＡ产生沉淀，形成包裹ＤＮＡ的黏稠胶状物，其难以溶解或产生褐变，使得ＤＮＡ提取质量较低，获得的ＤＮＡ溶液常常黏度大乃至呈胶状，这些物质如果清除不净则会影响后续的试验研究［２－４］。大戟属为大戟科植物中最大的一属，全世界有２０００余种

5、［5］，其中不少种具有很高的药用价值，李忠国［６］调查发现，安徽省琅琊山药用植物资源中有２２种大戟科药用植物；李惠等［７］通过研究华东地区大戟属药用植物资源后，整理出了２６种大戟属药用植物，并且药用部位明确，疗效确切，具有较高的药用价值。大戟属药用植物的医药价值使得其研究开发成为了热点，尤其是对大戟属药用植物在分子水平上的探讨方兴未艾。目前在大戟属药用植物进行分子标记试验中，由于本属植物具有白色或黄白色乳汁，含酚类、黄酮类等次生物质较多，若提取方法不当，不仅提取出来的ＤＮＡ容易降解，而且会影响ＰＣＲ扩增反应的稳定性和重复性。因此，如何高效简便地去除多糖、

6、多酚等次生物质，对提取纯化大戟属植物ＤＮＡ至关重要。目前，大戟属药用植物总ＤＮＡ提取方法的研究在国内外尚未见报道，所以在前期研究的基础上［８，９］，结合本属植物特点，以经典提取植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ法为基础［１０］，并加以改进，筛选出一种比较适合大戟属植物ＤＮＡ提取的方法，为大戟属药用植物进一步开发利用提供技术支持。　　１材料与方法　　１．１材料　　１．１．１供试材料试验所用植物材料为采自安徽省琅琊山的大戟、月腺大戟　　；采自芜湖市的乳浆大戟、斑地锦、地锦、一品红，原植物均经安徽师范大学周守标教授鉴定。用于提取ＤＮＡ的材料为各供试植物的新鲜叶片，采后迅速置

7、于冰盒中，带回实验室后，除去主叶脉，在电子天平上精确称取０．５ｇ，于－２０℃冰箱保存３ｄ。　　１．１．２主要试剂①ＤＮＡ抽提缓冲液，ＮａＣｌ５００ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０和ＥＤＴＡ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０。②ＤＮＡ裂解缓冲液，ＮａＣｌ７００ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０和　　ＥＤＴＡ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０，ＣＴＡＢ５％，β－巯基乙醇１％［１１］。③ＴＥ缓冲液，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０和ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值８．０。④５０×ＴＡＥ缓冲液，Ｔｒｉｓ

8、２４２ｇ，冰乙酸５７．１ｍＬ，ＥＤＴＡ１００ｍＬ。⑤氯仿－异戊醇混合液。配制药品