2×ctab法植物总dna提取

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1、2×CTAB法植物总DNA提取1.液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。2.加入500µl的2*CTAB(60℃或65℃预热),颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。a.离心后溶液

2、分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿b.迅速进入下一步，以免各相混合5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。6.在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。6-1在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2,3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15min至过夜。6-3.在抽提出的水相中加入加入

3、2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟至过夜。a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多7.12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。重复一遍。8.12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。9.在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。10.用琼脂糖凝胶检测结果。11.-20℃——-70℃低温保存。去除总DNA中的RNA污染先做预扩增实验，若R

4、NE污染无严重影响则舍去该步骤A1.在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或者TE溶液调整总体积至200µl,加入10µRNase-A（10mg/ml）4℃过夜，或者37℃1h.2.用等体积的24：1抽提。3.沉淀DNA——洗涤DNA——干燥DNA——溶解DNA——-20℃——-70℃低温保存。B直接加入10µRNase-A（10mg/ml）后冷冻保存。试剂配方1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)pH浓HClTris去离子水7.4约70ml121.1g定容至1升7.6约60ml121.1g定容至1升8.0约42ml121.1g定容至1升高温高压灭菌后，室温保

5、存注意：应该在溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH大约降低0.03个单位5×TBE缓冲液Tris硼酸0.5MEDTA（pH8.0）去离子水54g27.5g20ml定容至1L室温保存50×TAE缓冲液Tris冰乙酸0.5MEDTA（pH8.0）去离子水242g57.1ml100ml定容至1L室温保存2×CTAB成分终浓度已有溶液浓度配100ml所加量CTAB2%2gTris-HCl（pH8.0）100mM1M10mlEDTA20mM0.5M4mlNaCl1.4M5M28ml0.5MEDTA（pH8.0）二水

6、乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA·2H2ONaOH去离子水186.1g约20克定容至1L高温高压灭菌，室温保存。注：只有pH值接近8.0时，EDTA才能完全溶解。溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。耗材准备：需要灭菌者：1.5ml离心管、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、其他：卫生纸（吸水用）、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、离心管架子、离心管盒子、移液枪。CTAB法提取植物基因组药品：2*CTAB终浓度组分药品用量0.1M/L1MTris-HCl(pH8.0)100ml20nM/L0.5MEDTA(pH8.0)40mlNaCl82gCTAB20gPVP4020g加去

7、离子水800ml充分溶解定容到1L。120℃1.5个大气压，灭菌20分钟用之前加0.2-1%的0.5MEDTA(pH8.0)配制量：1L配制方法：1.称取186.1gNa2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。3.用NaOH调节pH值值8.0（约20gNaOH）。注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。4.加去离子水将溶液定容至1L。5.适量分成小份后，高温高压灭菌。6.室温保存1MTris-HCl(pH8.0)氯仿：异戊醇24:1异丙醇流程1、研钵预冷，叶片放入研钵，加液