杜鹃花叶片总rna的改良ctab法提取论文

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1、杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取论文郭秀莲，张正银，田萍，罗绍银，白洁，庄平【摘要】目的研究杜鹃花叶片总RNA的提取方法。方法一种适合富含次生代谢产物的杜鹃花叶片总RNA的提取方法——改良CTAB法。采用CTAB作为去污剂，分别用氯仿和水饱和酚反复抽提以及高浓度NaCl沉淀，以去除蛋白质、多糖和次生代谢物等杂质.freelethodforisolationoftotalRNAfromRhododendronleaf.MethodsAnimprovedCTABmethodRhododendronleaf,aplantetabolites.UsingchemicalCTAB

2、asdetergentintheextractionbuffer,theabsoluteethanolprecipitationofRNAedfinallyafterremovingofproteins,polysaccharides,andsecondarymetabolitesbysubsequentchloroform,H2O-saturatedphenolextractionandhighconcentrationNaClprecipitation,respectively.ResultsTheyieldedtotalRNAhadintegralityandhighp

3、uritybut.ConclusionThemethodmaybeappliedtosomedifficultRNAextractionplantsfullofpolyphenolandpolysaccharides,particularlyRhododendron.KeyprovedCTABMethod杜鹃花叶片中的蛋白质、多糖、多酚等次生物质含量多且复杂，严重影响了其RNA的提取质量，从而给此类植物的基因工程研究带来了诸多阻碍。由于多糖类胶状物质会严重堵塞过滤柱，所以即使使用商业提取试剂盒也不能得到高质量的RNA；另外，这类次生代谢物含量多的材料，市售的RNA提取试剂的针

4、对性也不强，不仅操作麻烦费时，而且很难同时解决RNA的质量和得率问题。虽然目前已建立了很多针对富含多糖多酚材料的RNA提取方法［1～5］，但还没有以杜鹃花为材料提取RNA的报道。因此，本实验以杜鹃花叶片为材料，借鉴CTAB法［6］并进行了改良，提出一套适合提取杜鹃花叶片总RNA方法。1材料与仪器1.1试剂与仪器提取液配方：2%CTAB(AGINGSYSTEM(SYNGENE)；紫外可见分光光度计：TU-1800(北京普析通用仪器有限责任公司)；PCR仪：Personalcycler(Biometra公司)。1.2材料多年生杜鹃花叶片采自龙池华西亚高山杜鹃园，采下后立即用液氮浇

5、淋，于-70℃贮存备用。2方法2.1几种试剂盒法提取杜鹃花叶片总RNARNAplant试剂提取法：试剂购自TIANGEN公司，实验操作按照说明书进行；TRIReagent试剂提取法：试剂购自Ambion公司，实验操作按照说明书进行；RNeasyPlantMiniKit试剂提取法：试剂购自QIAGEN公司，试验操作按照说明书进行。2.2改良CTAB法提取程序：①称取100mg的杜鹃花叶片，迅速放入液氮研磨至粉末状，转入1.5ml离心管内，加入65℃预热的0.75ml提取液，涡旋振荡混匀后65℃温浴20min。②加入与提取液等体积的水饱和酚，振荡摇匀，4℃12000r·min-1

6、离心10min。③上清转入新的无RNase离心管；加入与提取液等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，4℃，12000r·min-1离心10min。④吸上清装入新的离心管里，加入1/2上清体积5mol·L-1NaCl，摇晃混匀，再加入1/2体积氯仿，振荡混匀，4℃，12000r·min-1离心10min。⑤上清液转入新的无RNase离心管并加入等体积的异丙醇，温和混匀后室温放置10min，4℃12000r·min-1离心10min，小心倒掉上清液；加入1ml70%乙醇，4℃12000r·min-1离心1min，小心倒掉上清液；加入30～50μlDEPC处理水溶解沉淀。⑥加入DN

7、aseI(10U·μl-1)1μl混匀，37℃温浴30min。⑦加入100μlDEPC处理水稀释后，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，4℃，12000r·min-1离心10min。⑧吸上清液，加入1ml无水乙醇，-20℃静置2h。⑨4℃，12000r·min-1离心5min弃上清液，用70%的乙醇洗涤。⑩4℃，12000r·min-1离心10min弃上清，干燥后加入20μlDEPC处理水保存备用。2.3RNA完整性与质量检测使用各种方法提取时，样品的起始量均为100mg，得到的RNA样品都