沙棘叶片总 RNA 提取方法的比较研究.pdf

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1、江苏农业科学2014年第42卷第3期一33一李小婷，戴国礼，李彦龙，等．沙棘叶片总RNA提取方法的比较研究[J]．江苏农业科学，2014，42(3)：33—34，137沙棘叶片总RNA提取方法的比较研究李小婷，戴国礼，李彦龙。，曹有龙。，袁思安，高辉，李根前(1．西南林业大学，云南昆明650224；2．国家枸杞工程技术研究中心，宁夏银川750002)摘要：沙棘叶片富含多糖、多酚、蛋白质、类黄酮等次生代谢物质，用普通方法提取沙棘叶片总RNA时很难将其去除。本试验以沙棘叶片为材料，比较研究了改良Trizol法、RNAsimple总RN

2、A提取试剂盒(离心柱型)、RNAplantPlus总RNA提取试剂以及RNAplantPlus总RNA提取试剂改良法等4种方法对沙棘叶片总RNA的提取效果。结果表明，RNAplantPlus总RNA提取试剂改良法能从沙棘叶片中提取纯度较高的RNA，凝胶电泳显示条带清晰完整，鲜叶平均得率为298．1g／g，D瑚／D：∞比值为1．79，用该方法提取的沙棘叶片总RNA可以用于后续的分子生物学研究中。关键词：沙棘叶片；总RNA提取；提取方法中图分类号：$793．604文献标志码：A文章编号：1002—1302(2014)03—0033—0

3、2提取获得纯度高、质量好的RNA是进行eDNA第一链合0．1gPVP(聚乙烯吡咯烷酮)继续研磨，待液氮挥发后将混成、RT—PCR、RACE—PCR、eDNA全长克隆和Northern杂交合粉末迅速加人已装好Trizol的1．5mL无RNAase离心管等分子生物学研究的必要前提。沙棘(Hippophaerham-中，摇匀前迅速加入1O卢一巯基乙醇；加入氯仿之前加noidesLinn．)，又名醋柳、酸刺，是胡颓子科沙棘属(Hippo—2005mol／LNaC1混匀；氯仿抽提，取上清后加入等体积phae)的灌木或小乔木。沙棘广泛分布于黄

4、土高原、毛乌素沙酚一氯仿一异戊醇(体积比25：24：1)，重新抽提1次。地及其毗邻地区，在水土保持、防风固沙及治理砒砂岩等方面1．2．2RNAsimple总RNA提取试剂盒(离心柱型)参照天发挥着重要的生态作用。沙棘叶片中含有大量的多糖、多根公司试剂盒说明书进行。酚、粗蛋白、类黄酮等次生代谢物质，加之RNAase的广泛1．2．3RNAplantPlus总RNA提取试剂法参照天根公司存在，使获得纯度较高的沙棘叶片总RNA变得十分困难。传试剂说明书进行。使用前按照1：4的体积比将口一巯基乙统提取RNA的方法有异硫氰酸胍法、苯酚法、SD

5、S法、CTAB醇与RNAplantPlusreagent混合。法、Tris一硼酸法及Trizol法等，这些方法可以有效地提取大部1．2．4RNAplantPlus总RNA提取试剂改良法在加氯仿分动物组织RNA，但高等植物组织内含有一些多糖类和酚类之前按1：250的体积比加入DNA酶I，轻轻吹打混匀物质，使用这些方法很难去除。本试验采用4种RNA提取1min，然后参照天根公司试剂说明书进行。试剂(盒)进行系统比较分析，以期筛选出提取高质量沙棘叶1．2．5总RNA的完整性检测分别取5txL总RNA样品，在片总RNA的方法，为开展沙棘后

6、续分子生物研究奠定基础。l％琼脂糖凝胶电泳中检测，EB(溴化乙锭)中染色后，凝胶成像系统成像观察，记录结果。I材料与方法1．2．6总RNA的纯度检测将用4种方法提取的总RNA1．1材料分别取2，用无RNAase的DEPC水稀释50倍，在核酸蛋供试的沙棘叶片采自陕西省定边县西南林业大学实习基白仪上测定D：／D。和D／D。值，分析其纯度。地，为移栽后2年的实生苗嫩叶，采后迅速放入液氮中带回实得率(g／g)=D260×40(／xg／mL)x稀释倍数×RNA原验室一80℃保存。液体积(mL)／所取样品质量(g)。试验所用主要试剂有Triz

7、ol(Invitrogen公司产品)、2结果与分析RNAsimple总RNA提取试剂盒(离心柱型)(天根公司产品)、RNAplantPlus总RNA提取试剂(天根公司产品)，2．1沙棘叶片总RNA完整性分析DEPC(Sigma公司)，其他试剂均为RNA试验专用。4种不同方法提取的RNA经1％琼脂糖凝胶电泳(图1．2方法1)，结果表明，改良TRIzol法和RNAsimple总RNA提取试剂1．2．1改良Trizol法按照Invitrogen公司试剂说明书进盒(离心柱型)的凝胶电泳未检测出RNA；RNAplantPlus总行，并加以改

8、进：取0．tg沙棘叶片液氮研磨成细粉后加RNA提取试剂法得到的沙棘总RNA电泳图谱可以看到亮度很高的28S和18S2条带，且28条带与18S条带亮度比约为2：1，但在28S上方可见明显的其他条带，表明有基因组收稿日期：2013—10—29基金项目：