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1、北方园艺2011(14):111~113生物技术分蘖洋葱叶片RNA提取方法的比较和分析黄钰,李旭双,陈典,王勇(东北农业大学园艺学院,黑龙江哈尔滨150030)摘要:以新鲜的分蘖洋葱叶片为材料,比较了Trizol法、Trizol改进法、SDS法、SDS改进法以及柱式植物RNA提取法提取总RNA的效果。结果表明:Trizol法和Trizol改进法所提取的RNA得率很低,且不能有效除去叶片中的多糖成分;SDS改进法能够有效的去除分蘖洋葱叶片中的多糖,提取的RNA中28SRNA亮度约为18SRNA的2倍,OD260/OD280值介于
2、1.7~2.2之间,但RNA的得率偏低,约为56.32g/g;柱式植物RNA提取法提取的RNA28S、18S、5S条带清晰,完整性好,RNA的得率最高,为123.58g/g,完全适合于分蘖洋葱进一步的分子生物学研究。关键词:RNA;分蘖洋葱;SDS改进法;柱式植物RNA提取法中图分类号:S633.2文献标识码:A文章编号:1001-0009(2011)14-0111-03分蘖洋葱(AlliumcapeL.var.multiplcansBailey)为选取分蘖洋葱新鲜幼嫩的叶片,液氮速冻后带回百合科葱属草本植物,俗称毛葱,是洋葱的一
3、个变种。实验室使用。试材由东北农业大学葱蒜类课题组提其叶为中空圆筒状,植株密集丛生,不抽薹、不开花,或供,栽种于东北农业大学园艺设施中心。主要试剂:极少抽薹开花结实,以分蘖小鳞茎进行繁殖。鳞茎为狭Trizol购自Invitrogen公司,柱式植物RNA提取试剂卵形或卵形,聚生。每株蘖生多个至十多个大小不规则盒购自北京天恩泽基因科技有限公司,其余生化试剂的鳞茎,多为铜黄色,耐贮藏,植株抗寒性强,适于北方均为进口及国产分析纯。[1]地区栽培,是黑龙江传统栽培品种。1.2分蘖洋葱叶片RNA的提取方法RNA是一种重要的遗传信息分子,完整RNA的试验
4、所需塑料制品如Eppendorf管、吸头、PCR管提取和纯化是进行Northern杂交、RTPCR、定量PCR等均用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水37处理12h等RNA相关研究的重要前提。目前提取RNA的方以上,高温高压灭菌40min,180烘干后使用。玻璃法有很多种,但对于分蘖洋葱RNA的提取研究却未见器皿于180干热灭菌3h。用于RNA提取的所有配报道。分蘖洋葱各组织中富含多糖,在沉淀RNA时,制的溶液(Tris除外)均经0.1%DEPC水处理12h,高往往产生富含多糖的凝胶状沉淀,这种含有多糖的温高压灭菌后使用;含Tris的
5、溶液用经高温高压灭菌RNA沉淀难溶于水,或溶解后产生粘稠状的溶液,在的0.1%DEPC处理水配制。去除多糖的同时RNA也容易被带走,造成RNA得率1.2.1Trizol法参照Invitrogen公司的试剂说明书的减少,因此从分蘖洋葱中提取高质量的RNA有相当进行(Cat.No.15596018)。[2]的难度。另外,多糖还会抑制许多酶的活性,因此含1.2.2Trizol改进法依Trizol步骤,清洗沉淀后弃有多糖的RNA样品很难满足进一步分子生物学研究去上清,沉淀中加入0.5mLDEPC水,1/3体积8mol/L的需要。现通过比较T
6、rizol法、Trizol改进法、SDS法、LiCl溶液,4静置6~8h。4,12000r/min离心10SDS改进法以及TIANDZ柱式植物RNAout试剂盒方min。弃去上清,加入适量DEPC水,再加入2倍体积法以期找到一种适合于分蘖洋葱叶片RNA提取的最无水乙醇,室温静置10~20min。4,12000r/min离优方法。心10min,沉淀RNA。弃去上清,用75%乙醇清洗沉1材料与方法淀。将沉淀室温自然晾干后加入适量DEPC水,将沉淀充分溶解,-70保存。1.1试验材料[3]1.2.3SDS法参照王玉成等方法。1.2.
7、4SDS改进法向1.5mL离心管中分别加入了第一作者简介:黄钰(1985),女,在读硕士,研究方向为寒地作物0.6mLSDS提取液、0.06mL巯基乙醇、0.4mLTris(葱蒜类)分子育种。Email:huangyu0524@sina.com。苯酚和0.3mL氯仿;将0.1g分蘖洋葱叶片液氮速冻研责任作者:王勇(1972),女,博士,副教授,研究方向为寒地作物磨后,迅速加入EP管中,剧烈震荡3min。12000r/min(葱蒜类)分子育种。Email:acaciawy@yahoo.com.cn。离心5min,取上清,加入0
8、.3mLTris苯酚和0.3mL氯基金项目:黑龙江省高校重点实验室开放基金资助项目仿,震荡2min。以下依照SDS方法进行。(GS2009004);农业部公益性行
