欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:25229429
大小:53.00 KB
页数:5页
时间:2018-11-18
《改良盐酸胍法提取脐血dna用于hla基因分型论文》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、改良盐酸胍法提取脐血DNA用于HLA基因分型论文.freelCordBloodUsedinHLAGenotypingAbstractToparetethodsforextractinggenomicDNAfromcordbloodandtoevaluatetheirapplicationsforHLAgenotyping,thegenomicDNAfrom72samplesodifiedguanidinehydrochloride,theDNAyieldandpurityetryanddetectedbyPCRers.TheresultshoicDNAe
2、thods.ThemodifiedGu·HClmethodusedethodasthemodifiedmethodproducesbetterqualityofDNAandlessambiguousbandsinPCR.ItisconcludedthatmodifiedGu·HClmethodhastheadvantagesoflopleoperation,highqualityoutputandclearpositivebandsinHLA-genotyping,themodifiedmethodisoptimalforextractingDNAfro
3、mmultiplesamplesofcordbloodbank.Keyethod;modifiedguanidinehydrochloridemethod;HLAgenotype高产量和高纯度的真核细胞DNA分离技术是进行PCR,Southernblot等分子生物学研究的前提条件,而在HLA基因分型中,模板DNA的质量是分型结果准确性的重要保证。Boa产品),MicroSSPTM试剂盒(美国莱姆德公司产品)。主要仪器高速冷冻离心机(HermleZK380)、紫外分光光度仪(PharmaciaGeneQuatII)、PE-9600PCR仪(PerkinEl
4、mer),自动凝胶成像仪(Phamacia)。DNA提取盐酸胍法[1]取200μl脐血标本用生理盐水洗3-4次,离心至上层液体清晰,弃去上清液后,加入6mol/L盐酸胍200μl和0.1mol/L醋酸钠200μl(pH5.5),充分混匀,至少1小时。取以上液体至5ml冰冷无水乙醇中,小心吸放,使絮状物缠绕成团。将絮状DNA吸至新的1.5ml离心管中,离心,加70%乙醇洗1次,离心。室温干燥后加无菌水溶解。-20℃保存。改良盐酸胍法取600μl脐血标本用生理盐水洗3-4次,离心至上层液体清晰,弃去上清液后加入6mol/L盐酸胍300μl和0.1mol/L醋
5、酸钠300μl(pH5.5),充分混匀,至少1小时。在原1.5ml离心管立即加入氯仿,颠倒混匀,离心,取上清液平分到2个新的1.5ml离心管中,分别加入等量的异丙醇,颠倒混匀至有絮状DNA沉淀出现,离心,弃上清。用70%乙醇洗1次,离心。室温干燥后,一管加无菌水溶解,另一管为干粉状。-20℃保存。DNA质量测定72份经-20℃保存的CPD-A抗凝脐血标本分别采用以上2种方法进行DNA抽提,所得的DNA经PharmaciaGeneQuatⅡ紫外分光光度计测定浓度和纯度(A280/A260)。HLA基因配型采用PCR-SSP方法。随机挑选不同方法的不同脐血按
6、操作方法按美国莱姆德公司的MicroSSPTM试剂盒(HLA-DRB)说明书进行HLA基因配型。PCR产物经常规琼脂糖电泳后,EB染色,自动成像仪照相。利用人工和电脑软件同时判读实验结果。结果DNA的提取结果和纯度测定受测试的72份脐血标本,用盐酸胍法和改良的盐酸胍法提取DNA,两种方法均全部成功,但后者优于前者,结果见附表。Table.PurificationofDNAbymeansofGu·HClmethodandmodifiedGu·HClmethod(略)HLA基因分型盐酸胍法和改良盐酸胍法提取的DNA基因分型结果,见图1和图2。图1显示,除内参
7、条带和阳性条带外,在电泳孔附近出现非特异性条带及拖尾现象,以及在最后一孔出现弱的假阳性条带,这是由于DNA的纯度不足所致,在判断结果时会产生不良影响。从图2可见,由于DNA的质量改进,以上的现象大有改善,这样增加了基因分型的准确性。讨论HLA基因分型随着在临床移植中应用的开展,发展迅速,相继建立了各种的DNA分型方法。这些方法可以检测出仅相差几个碱基的HLA等位基因,如PCR-SSOP方法能探测出1-2个碱基的差异[2]。在引物的选择与设计,酶的质量都稳定可行的情况下,各种DNA分型方法的关键在于模板DNA的制备。传统的模板DNA提取方法是采用去垢剂如S
8、DS等来破坏细胞组分,溶解细胞膜,使蛋白质变性,再用蛋白酶K来消化去除蛋白质,尤
此文档下载收益归作者所有