改良盐酸胍法提取脐血dna用于hla基因分型论文

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1、改良盐酸胍法提取脐血DNA用于HLA基因分型论文.freelCordBloodUsedinHLAGenotypingAbstractToparetethodsforextractinggenomicDNAfromcordbloodandtoevaluatetheirapplicationsforHLAgenotyping，thegenomicDNAfrom72samplesodifiedguanidinehydrochloride，theDNAyieldandpurityetryanddetectedbyPCRers.TheresultshoicDNAe

2、thods.ThemodifiedGu·HClmethodusedethodasthemodifiedmethodproducesbetterqualityofDNAandlessambiguousbandsinPCR.ItisconcludedthatmodifiedGu·HClmethodhastheadvantagesoflopleoperation，highqualityoutputandclearpositivebandsinHLA-genotyping，themodifiedmethodisoptimalforextractingDNAfro

3、mmultiplesamplesofcordbloodbank.Keyethod;modifiedguanidinehydrochloridemethod;HLAgenotype高产量和高纯度的真核细胞DNA分离技术是进行PCR，Southernblot等分子生物学研究的前提条件，而在HLA基因分型中，模板DNA的质量是分型结果准确性的重要保证。Boa产品），MicroSSPTM试剂盒（美国莱姆德公司产品）。主要仪器高速冷冻离心机（HermleZK380）、紫外分光光度仪（PharmaciaGeneQuatII）、PE-9600PCR仪（PerkinEl

4、mer），自动凝胶成像仪（Phamacia）。DNA提取盐酸胍法［1］取200μl脐血标本用生理盐水洗3-4次，离心至上层液体清晰，弃去上清液后，加入6mol/L盐酸胍200μl和0.1mol/L醋酸钠200μl（pH5.5），充分混匀，至少1小时。取以上液体至5ml冰冷无水乙醇中，小心吸放，使絮状物缠绕成团。将絮状DNA吸至新的1.5ml离心管中，离心，加70%乙醇洗1次，离心。室温干燥后加无菌水溶解。-20℃保存。改良盐酸胍法取600μl脐血标本用生理盐水洗3-4次，离心至上层液体清晰，弃去上清液后加入6mol/L盐酸胍300μl和0.1mol/L醋

5、酸钠300μl（pH5.5），充分混匀，至少1小时。在原1.5ml离心管立即加入氯仿，颠倒混匀，离心，取上清液平分到2个新的1.5ml离心管中，分别加入等量的异丙醇，颠倒混匀至有絮状DNA沉淀出现，离心，弃上清。用70%乙醇洗1次，离心。室温干燥后，一管加无菌水溶解，另一管为干粉状。-20℃保存。DNA质量测定72份经-20℃保存的CPD-A抗凝脐血标本分别采用以上2种方法进行DNA抽提，所得的DNA经PharmaciaGeneQuatⅡ紫外分光光度计测定浓度和纯度（A280/A260）。HLA基因配型采用PCR-SSP方法。随机挑选不同方法的不同脐血按

6、操作方法按美国莱姆德公司的MicroSSPTM试剂盒（HLA-DRB）说明书进行HLA基因配型。PCR产物经常规琼脂糖电泳后，EB染色，自动成像仪照相。利用人工和电脑软件同时判读实验结果。结果DNA的提取结果和纯度测定受测试的72份脐血标本，用盐酸胍法和改良的盐酸胍法提取DNA，两种方法均全部成功，但后者优于前者，结果见附表。Table.PurificationofDNAbymeansofGu·HClmethodandmodifiedGu·HClmethod（略）HLA基因分型盐酸胍法和改良盐酸胍法提取的DNA基因分型结果，见图1和图2。图1显示，除内参

7、条带和阳性条带外，在电泳孔附近出现非特异性条带及拖尾现象，以及在最后一孔出现弱的假阳性条带，这是由于DNA的纯度不足所致，在判断结果时会产生不良影响。从图2可见，由于DNA的质量改进，以上的现象大有改善，这样增加了基因分型的准确性。讨论HLA基因分型随着在临床移植中应用的开展，发展迅速，相继建立了各种的DNA分型方法。这些方法可以检测出仅相差几个碱基的HLA等位基因，如PCR-SSOP方法能探测出1-2个碱基的差异［2］。在引物的选择与设计，酶的质量都稳定可行的情况下，各种DNA分型方法的关键在于模板DNA的制备。传统的模板DNA提取方法是采用去垢剂如S

8、DS等来破坏细胞组分，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤