PCR-SSP方法用于HLA-Ⅱ类基因分型的研究.pdf

《PCR-SSP方法用于HLA-Ⅱ类基因分型的研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、滨州医学院学报JOURNALOFBINZHOUMEDICALCOLLEGE2004年第27卷第5期VoI.27No.52004PCR-SSP方法用于HLA-H类基因分型的研究II22周淑华，胡敬富，林麟，靳培英（I滨州医学院附属医院，滨州市256603；2医科院皮肤病研究所，南京市）【摘要】目的：探索可靠的HLA-H类基因分型的分子生物学方法。方法：采用序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）技术进行HLA-DRBI、DOBI基因的分型，并与系列标准DNA作对照。结果：用PCR-SSP方法进行HLA-H类基因分型时，实验结果准确可靠，重复性好；分型结果较血清学方法精细，对一些血清

2、学特异性相同的，可借助PCR-SSP技术分出其基因型别的差异。结论：PCR-SSP方法可用于HLA-H类基因分型的实验和临床研究。【关键词】PCR-SSP；DRBI基因；DOBI基因；人类白细胞抗原【中图分类号】R446.6I【文献标识码】A【文章编号】I00I-95I0（2004）05-0326-02THEUSEOFPCR-SSPINTHEHLACLASSHGENETPINGZHOUShuhua，HUJingfu，LINLin，!"#$（AffiIiatedHospitaIofBinzhouMedicaICoIIege，Binzhou256603，Shandong）【ABSTRACT

3、】Objective：ToinvestigatemoIecuIarbioIogymethodforHLAcIassHgenetyping.Methods：WeusedpoIymerasechainreaction-specificseguenceprimerstotypeHLA-DRBIandDOBIsub-region，andcomparedtheresuItswithseriesstandardDNA.Results：Thistechnigueisaccurateandhasgoodrepeat-abiIityinHLA-cIassHgenetyping.Itismorerefin

4、ethanseroIogicmethod.Conclusion：PCR-SSPcanbeusedintheHLAIaboratoryandcIinicstudy.【KEWORDS】PCR-SSP；DRBIgene；DOBIgene；HLA［I］分子生物学技术的广泛应用，促进了对人类白饱和盐洗法提取基因组DNA。细胞抗原（humanIeukocyteantigen，HLA）的研究向I.5PCR-SSP总反应体积为50卜I，其中包括：基更精细化发展。血清学分型方法有一定局限性，如因组DNA60ng，浓度为50pmoI/L的上游引物和下存在交叉反应、重复性差等。HLA分子氨基酸序列游引物各2

5、.5卜I，阳性对照引物用量为特异性引物的差别归根到底是HLA多态性等位基因核苷酸序的I/5，I0XPCR缓冲液5卜I，25mmoI/LMgCI5卜I，列不同造成的。我们采用序列特异性引物-聚合酶2.5mmoI/LdNTP5卜I，Tag-DNA聚合酶（Promega）链反应（PCR-SSP）成功地进行了HLA-DRBI、DOBII.5u。扩增在DNA热循环仪扩增仪（PerkinEI-基因的分型，现将结果报告如下。mer）上进行。PCR反应条件参考文献［2，3］。I材料与方法I.6基因型的确定2%的琼脂糖凝胶电泳，I00VI.I标本来源健康查体者共57例，年龄2I~76稳压30min。紫外

6、线灯下观察，根据PCR产物的有岁，平均年龄（53.I71I5.93）岁；其中男35例，女无及大小确定基因型别。22例。I.7结果分析与质量控制①阳性对照引物应扩I.2标准DNA系列标准DNA———DRBI＊0405，增出796bp的片段，在相同的反应条件下，特异性DR7，DR9，DRI0，DRBI＊I202，DRBI＊I30I，DRBI片段与阳性对照产物均应阳性。②DRBI阳性等位＊I405，DOBI＊030I，DOBI＊0303，DOBI＊0503由基因的数目。大多数情况下，每位患者/健康者可检上海免疫学研究所上海第二医科大学免疫学研究室出两个DRBI等位基因；在纯合子的情况下，只能

7、检范丽安教授馈赠。出一个等位基因；因此当检出两个以上DRBI等位I.3PCR-SSP所用引物所用的HLA-DR基因引基因时，即为假阳性结果，应重新检测。③HLA-物、HLA-DOBI基因引物由中国医学科学院细胞生DRB3、DRB4特异性引物，其扩增的等位基因分别物研究所上海赛尔公司合成。与不同的DRBI等位基因关联，DRB3与DRBI＊I.4基因组DNA的制备分离静脉血白细胞，用03，DRBI＊II，DRBI＊I2，DRBI＊I3，DRBI＊I