大鼠甲状旁腺细胞体外培养及功能的实验研究

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1、大鼠甲状旁腺细胞体外培养及功能的实验研究作者：董建敏　夏永兴　杨春雷【摘要】目的：探讨大鼠甲状旁腺细胞的培养方法及其分泌功能，为甲状旁腺细胞移植奠定实验基础。方法：胶原酶和胰蛋白酶系列消化甲状旁腺后，进行细胞培养。透射电镜检查培养5d的甲状旁腺细胞，对1、3、5、7d的细胞培养液行甲状旁腺激素测定。结果：培养5d的甲状旁腺细胞具有丰富的粗面内质网、高尔基复合体、杆状的线粒体和分泌颗粒。甲状旁腺细胞经过培养后可以正常分泌甲状旁腺激素，以第5天为最佳。结论：培养5d的甲状旁腺细胞仍保持原有的形态结构，分泌功能最强，可作为同种移植的最佳供体。【关键词】甲状

2、旁腺·细胞培养·甲状旁腺激素【ABSTRACT】Objective:Toinvestigatetheculturetechniqueandsecretoryfunctionofparathyroidcellsinratsinordertoestablishexperimentalbasisofparathyroidcelltransplantation.Methods:Afterparathyroidglandsissionelectronmicroscopy.donorHLAclassIantigens[J].Science,1991,252(50

3、13):1700-1702.（收稿日期：2008-01-05）tively.Results:Parathyroidcellsculturedfor5dayshadabundantroughsurfacedendoplasmicreticula、Golgibodies、stabmitochondriaandsecretorygranules.Culturedparathyroidcellscouldsecreteparathyroidhormonenormally,especiallyonthe5thday.Conclusion:Parathyroid

4、cellsculturedfor5daysstillpossessoriginalmorphologicstructureandhavemaximumsecretingfunction,soitisanoptimaldonorfortransplantation.【KEYI1640培养液(Gibco公司)、甲状旁腺激素(parathyroidhormone，PTH)N-tactPTHIRMA26100放免试剂盒(美国DiaSorin公司)、JEM-1220透射电镜（日本JEOL公司）和CO2培养箱（德国Heraeus公司）。1.2　实验方法1.2.1

5、　PTG切取与细胞培养　I1640培养液中漂洗，吸除培养液，剪成1mm×1mm×1mm大小的碎块。加入2.5%的胶原酶在37℃恒温水浴中振荡消化10min，然后用Hank’s液洗2遍，再以0.25%的胰蛋白酶消化5min，RPMI1640（含15%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100g/mL）培养液终止消化。离心去上清后移入含RPMI1640培养液的培养瓶中。细胞浓度为1×105mL-1。台盼蓝染色计数细胞活力，培养瓶置于37℃内充95%空气，5%CO2的培养箱中恒温培养。倒置显微镜下观察不同时段的细胞形态。1.2.2　PTH测定　无菌技术收

6、集1、3、5、7d的PTG细胞培养液各9瓶，-80℃冻存备用，统一检测PTH。1.2.3　透射电镜观察　采用无菌技术在培养5d的PTG细胞培养瓶内加入1.0mL0.25%的胰蛋白酶液（预加温至37℃），静置3min，其间置于倒置相差显微镜下观察。待细胞质回缩、细胞间隙增大后，立即加入含有胎牛血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养液，轻轻反复吹打瓶壁细胞，然后将细胞悬液移入离心管，离心去上清后立即沿管壁加入3%戊二醛固定，常规切片，透射电镜观察。1.3　统计学处理　采用SPSS11.5软件包进行数据分析，数据均以x±s表示，两样本间用t检验，检验水准α=

7、0.05。2　结果2.1　PTG细胞形态的观察　各培养瓶中PTG细胞成活率均＞90%。倒置显微镜下见细胞散在分布，呈圆形，均质且透明。12h后细胞附于培养瓶底面，并见少数细胞开始放射状延展。72h后细胞大部分贴壁并相互连接成片，呈多角形或星形，细胞核圆、居中，呈现上皮细胞的形态特征。此后细胞完全贴壁，可见少量成纤维细胞（图1）。2.2　PTH测定结果　第1、3、5和7天PTG细胞培养液的PTH水平分别为（17.79±2.77）、（45.07±7.42）、（76.49±6.86）和（53.61±5.53）ng/L。以培养5d的PTG细胞分泌PTH最高，

8、与培养1、3和7d的PTH分泌水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。2.3　透射电镜检查结果　培养的