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时间:2018-11-18
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1、大鼠甲状旁腺细胞体外培养及功能的实验研究作者:董建敏 夏永兴 杨春雷【摘要】目的:探讨大鼠甲状旁腺细胞的培养方法及其分泌功能,为甲状旁腺细胞移植奠定实验基础。方法:胶原酶和胰蛋白酶系列消化甲状旁腺后,进行细胞培养。透射电镜检查培养5d的甲状旁腺细胞,对1、3、5、7d的细胞培养液行甲状旁腺激素测定。结果:培养5d的甲状旁腺细胞具有丰富的粗面内质网、高尔基复合体、杆状的线粒体和分泌颗粒。甲状旁腺细胞经过培养后可以正常分泌甲状旁腺激素,以第5天为最佳。结论:培养5d的甲状旁腺细胞仍保持原有的形态结构,分泌功能最强,可作为同种移植的最佳供体。【关键词】甲状
2、旁腺·细胞培养·甲状旁腺激素【ABSTRACT】Objective:Toinvestigatetheculturetechniqueandsecretoryfunctionofparathyroidcellsinratsinordertoestablishexperimentalbasisofparathyroidcelltransplantation.Methods:Afterparathyroidglandsissionelectronmicroscopy.donorHLAclassIantigens[J].Science,1991,252(50
3、13):1700-1702.(收稿日期:2008-01-05)tively.Results:Parathyroidcellsculturedfor5dayshadabundantroughsurfacedendoplasmicreticula、Golgibodies、stabmitochondriaandsecretorygranules.Culturedparathyroidcellscouldsecreteparathyroidhormonenormally,especiallyonthe5thday.Conclusion:Parathyroid
4、cellsculturedfor5daysstillpossessoriginalmorphologicstructureandhavemaximumsecretingfunction,soitisanoptimaldonorfortransplantation.【KEYI1640培养液(Gibco公司)、甲状旁腺激素(parathyroidhormone,PTH)N-tactPTHIRMA26100放免试剂盒(美国DiaSorin公司)、JEM-1220透射电镜(日本JEOL公司)和CO2培养箱(德国Heraeus公司)。1.2 实验方法1.2.1
5、 PTG切取与细胞培养 I1640培养液中漂洗,吸除培养液,剪成1mm×1mm×1mm大小的碎块。加入2.5%的胶原酶在37℃恒温水浴中振荡消化10min,然后用Hank’s液洗2遍,再以0.25%的胰蛋白酶消化5min,RPMI1640(含15%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100g/mL)培养液终止消化。离心去上清后移入含RPMI1640培养液的培养瓶中。细胞浓度为1×105mL-1。台盼蓝染色计数细胞活力,培养瓶置于37℃内充95%空气,5%CO2的培养箱中恒温培养。倒置显微镜下观察不同时段的细胞形态。1.2.2 PTH测定 无菌技术收
6、集1、3、5、7d的PTG细胞培养液各9瓶,-80℃冻存备用,统一检测PTH。1.2.3 透射电镜观察 采用无菌技术在培养5d的PTG细胞培养瓶内加入1.0mL0.25%的胰蛋白酶液(预加温至37℃),静置3min,其间置于倒置相差显微镜下观察。待细胞质回缩、细胞间隙增大后,立即加入含有胎牛血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养液,轻轻反复吹打瓶壁细胞,然后将细胞悬液移入离心管,离心去上清后立即沿管壁加入3%戊二醛固定,常规切片,透射电镜观察。1.3 统计学处理 采用SPSS11.5软件包进行数据分析,数据均以x±s表示,两样本间用t检验,检验水准α=
7、0.05。2 结果2.1 PTG细胞形态的观察 各培养瓶中PTG细胞成活率均>90%。倒置显微镜下见细胞散在分布,呈圆形,均质且透明。12h后细胞附于培养瓶底面,并见少数细胞开始放射状延展。72h后细胞大部分贴壁并相互连接成片,呈多角形或星形,细胞核圆、居中,呈现上皮细胞的形态特征。此后细胞完全贴壁,可见少量成纤维细胞(图1)。2.2 PTH测定结果 第1、3、5和7天PTG细胞培养液的PTH水平分别为(17.79±2.77)、(45.07±7.42)、(76.49±6.86)和(53.61±5.53)ng/L。以培养5d的PTG细胞分泌PTH最高,
8、与培养1、3和7d的PTH分泌水平比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。2.3 透射电镜检查结果 培养的
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