茶多酚对大鼠及体外培养的血管内皮细胞纤溶功能的保护作用的研究

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1、山东大学硕士学位论文茶多酚对大鼠及体外培养的血管内皮细胞纤溶功能的保护作用研究研究生裴晶晶导师赵秀兰教授中文摘要目的动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是绝大多数心脑血管疾病的重要病理基础，纤维蛋白溶解系统在防止血栓形成，保证血流通畅方面有重要作用。内皮细胞分泌的组织型纤溶酶原激活物(tissue-typeplasminogenactivator，t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(type-1plasminogenactivatorinhibitor，PAI一1)是纤溶系统外源性激活途径中最重要的两种活性物质，二者之间的平衡是体内纤溶功能的决定因素。蛋氨酸的代谢产物

2、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)作为AS的独立危险因素已经得到证实，Hcy损伤内皮细胞纤溶功能是引起AS的主要机制之一。茶多酚(teapolyphenols，TP)是从茶叶中提取的一类多羟基酚类化合物的总称，TP对AS的防护作用己受到广泛关注，但其机制尚未完全明了，尤其是关于TP能否通过保护内皮细胞纤溶功能来防治AS的研究甚少。本实验将通过高蛋氨酸饮食和Hcy分别诱导大鼠和人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)纤溶功能损伤，观察给予TP后t．PA和PAI．1蛋白水平和mRNA水平的变化，旨在从体内和体外实验综合

3、探讨TP对血管内皮的保护作用和对纤溶功能的影响，通过翔实的实验数据为TP抗AS提供进一步的理论依据。方法1．TP对体外培养的HUVEC纤溶功能的保护作用1．1细胞培养将冻存的HUVEC复苏后，37℃、5％C02、饱和湿度条件下培养。1．2四唑盐(methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法筛选TP和Hcy浓度将处于对数生长期的HUVEC分为TP组和Hcy组，各组分别加入不同浓度的TP和Hcy，使TP终浓度分别为12．5、25、50、100、200lxg／ml，Hcy终浓度分别为O．5、1、2、4mmol／L，同时各组分别设溶剂对照组和不接种细胞的空白对照，培养2

4、4h后采用MTT法测定细胞增殖率。山东大学硕士学位论文1．310pg／naTP对t-PA、PAI一1含量及mRNA水平的影响将处于对数生长期的HUVEC分为4组：Hcy组：加入终浓度为0．5mmol／L的Hcy；TP组：加入终浓度为10“咖l的TP；Hcy+TP组：加入终浓度为0．5mmol／L的Hcy与10lxg／ml的TP；对照组：加入等体积溶剂。各组培养24h后镜下观察细胞形态学改变，ELISA法测定细胞上清液中的t-PA和PAI．1含量，RT．PCR法检测细胞t-PA和PAI一1mRNA水平。1．4不同给予方式，不同浓度TP对t．PA、PAl．1含量的影响1．4．1同时给予TP

5、和Hcy组：将处于对数生长期的细胞按下列分组同时给予不同处理因素：Hey组、2lxg／mlTP+Hcy组、41．tg／mlTP+Hcy组、8lag／mlTP+Hcy组、16I-tg／mlTP+Hcy组、对照组。各组Hcy终浓度均为O．5mmol／L，对照组加入等体积溶剂，ELISA法测定细胞上清液中的t．PA和PAI一1含量。1．4．2先给予Hcy组：按上述方法接种细胞并分组后，各组先给予终浓度为0．5mmol／L的Hcy作用12h，换液，Hcy组与正常对照组加入等体积溶剂，其余四组分别给予2、4、8、161．tg／mlTP，继续培养24h，ELISA法测定细胞上清液中的t-PA和PA

6、I—l含量。2．TP对大鼠纤溶功能的保护作用研究2．1动物分组健康Wistar雄性大鼠(200士20g)50只随机分为对照组、模型组、TP低、中、高剂量组共5组，每组lO只，适应性喂养1周后，模型组及TP组均喂饲含3％蛋氨酸的饲料，同时各TP组每天经灌胃分别给予50mg／kg·bwTP、100mg／kg·bwTP和200mg／kg·bwTP，灌胃量为O．5ml／lOOg·bw；对照组喂饲正常基础饲料，对照组和模型组同时经灌胃给予等容量的蒸馏水。大鼠喂养8周后禁食12h断头处死。2．2指标测定ELISA法测定大鼠血浆t．PA和PAl．1含量；反转录聚合酶链反应(reversetransc

7、riptionpolymerasechainreaction，RT—PCR)检测大鼠主动脉t—PA和PAI一1mRNA水平的变化；苏木素．伊红(HE)染色观察主动脉弓病理变化；SABC免疫组织化学法测定大鼠主动脉弓t．PA和PAI一1蛋白表达；试剂盒测定大鼠血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，2山东大学硕士学位论文GSH．Px)活性、一氧化氮(nitricox