锰对pc12细胞生长增殖及对erk信号转导通路的影响论文

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1、锰对PC12细胞生长增殖及对ERK信号转导通路的影响论文李妍，陈景元，蔡同建，郑刚，杜可军，骆文静【关键词】MnCl2；大鼠；嗜铬细胞瘤PC12细胞；p【Abstract】AIM:TostudythetoxicityofdifferentdosesofMnCl2onratpheochromocytomaPC12cellsinvitroandtheireffectsonsignaltransductionofextracellularsignalregulatedkinase1/2(ERK1/2).METHODS:PC12cell

2、culturesol/L.Theinhibitionofthecellsduring7dinedbyMTTassayandplatecloneformationtest,andERK1/2andpERK1/2inedbynCl2atdifferentconcentrations(100,300,500,700and900μmol/L)couldinhibitthegroedependentmannerandthecellgroanner(P0.05).CONCLUSION:MnCl2cansignificantlyinhibit

3、thegroocytomaPC12cell;pERK1/2【摘要】目的：研究不同浓度的锰对PC12细胞生长增殖及细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号转导通路的影响.方法：体外培养大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，以100~900μmol/LMnCl2染毒后进行四唑盐比色实验(MTT)筛选锰的细胞毒性剂量，平板克隆形成实验观察MnCl2对细胞的抑制作用.TT、平板克隆形成实验结果显示100～900μmol/LMnCl2对细胞的生长增殖有不同程度的抑制作用(P0.05).APKs)信号转导通路在胞浆信号转导中起重要作用［3］，

4、其中，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignalregulatedkinase,ERK)在所有MAPKs家族成员中最早被认识，且最具特征性.被认为是一种增殖、转化和分化MAPKs［4］.本研究以多巴胺能PC12细胞为研究对象，观察染锰不同浓度及不同时间对细胞增殖的毒性作用和对胞内ERK1/2磷酸化水平的影响，探讨锰对神经系统损伤的可能机制，为阐明锰神经毒作用的分子机制,寻求科学的诊断和治疗方法提供新的线索.1材料和方法1.1材料高分化PC12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院；胎牛血清，杭州四季青公司产品；

5、DMEM培养基，美国Gibco公司产品；细胞培养箱，英国FormaScientific公司产品；MTT，美国Sigma公司产品；ERK1/2抗体(兔单抗)及pERK1/2抗体(鼠单抗)购于美国CellSignaling公司.1.2方法1.2.1MTT法绘制细胞生长曲线PC12细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，于含50mL/LCO2的37℃孵箱中湿化培养，取对数生长期的细胞按5×103个/孔接种于96孔板(Costar)中，待细胞铺满50%后，对照组仍以原培养基继续培养，各给药组分别给予含100,300,500,70

6、0和900μmol/LMnCl2的培养基进行四唑盐比色实验，用酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔的吸光值(A值)，记录结果.MnCl2对细胞增殖的毒性作用以抑制率(IR)表示，其计算公式如下：IR(%)＝(A对照组-A给药组)/A对照组×100并以时间为横轴，A值为纵轴，使用MicrosoftExcel软件绘制细胞生长曲线.1.2.2平板克隆形成实验检测细胞活力对数生长期PC12细胞500个/孔接种在24孔板(Costar)中，每组细胞各铺3孔.培养24h后换以0,100,.freelol/LMnCl2培养液，分别培养24,

7、48和72h后，换以不含MnCl2的培养液，继续培养12～15d，弃去培养液，PBS(0.01mol/L,pH7.4)小心浸洗2次.加纯甲醇5mL固定15min.弃去固定液，加适量姬姆萨应用液染色20min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥.显微镜下计数50个细胞的克隆数，每组实验重复3次，计算克隆形成率及抑制率.1.2.3nCl2的DMEM培养基培养3d后，用预冷的PBS吹打收集细胞，预冷的裂解液每组100μL冰上裂解10min，用改进的Folin酚法定量蛋白，每组样品取25μg蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，冰水浴条件下电转.将N

8、C膜以50g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1h.将ERK1/2及pERK1/2一抗分别用封闭液按1∶1000稀释后加于NC膜上，4℃过夜；用封闭液洗膜3次×8min，将二抗用封闭液按比例稀释后滴加于NC膜上，37℃作用1h；TBS洗膜3次×8min.待NC膜稍干后，