胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞增殖和erk表达的影响论文

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1、胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞增殖和ERK表达的影响论文姜志茹，龚均，张珍妮，曾文斌【关键词】胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类InfluenceofbileacidonproliferationandERKexpressioninhumannormalesophagealepithelialcells【Abstract】AIM:Toobservetheinfluenceofbileacidoncellproliferationandtheexpressionofextracellularsignalregulated

2、proteinkinase(ERK)inhumannormalesophagealepithelialcellsinvitro.METHODS:Humannormalesophagealepithelialcellsculturedinvitroediacontaining6differentkindsofbileacids(250μmol/L)respectivelyfor360min,inparisonalmediaetry.TheexpressionofphosphorylatedERK1/2proteininedbytheimmu

3、noblottingtechnique.RESULTS:Bileacidexposed(312min)esophagealepithelialcellsexhibitedasignificantincreaseinproliferation,especiallyinSphaseofthecellcycle,andthelevelofphosphorylatedERK1/2protein.TT法和流式细胞技术测定细胞增殖状态.免疫印迹法测定磷酸化ERK1/2蛋白表达.结果：胆酸的短时间（3~12min）作用使细胞增殖比大于1，S期细胞比率升

4、高，磷酸化ERK1/2蛋白表达增加.当作用时间大于20min时.freelitogenactivatedproteinkinase,MAPK)是细胞内信号转导的重要信号分子，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK)是MAPK通路的主要途径之一，与细胞的增殖凋亡有关［2］.为了进一步探讨胆汁反流的致病机制，本文首次研究了胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响.1材料和方法1.1材料人角朊细胞培养液KSFM（keratinocyteserumfreeme

5、dium）及牛垂体提取物（BPE）,重组表皮生长因子（rEGF）（Gibco公司）.甘氨胆酸钠(GC),甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC),牛磺胆酸钠(TC),牛磺鹅脱氧胆酸钠(TCDC),胆酸(CA)及脱氧胆酸(DCA)（Sigma公司），分别溶于KSFM制成250μmol/L的胆酸溶液.抗人细胞角蛋白14单克隆抗体（CK14）（上海长岛生物有限公司）.抗磷酸化ERK1/2抗体、抗ERK1/2抗体（美国CST公司）.RIPA细胞裂解试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）.BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒（美国Pierce公司）.1.2方法1

6、.2.1细胞培养、鉴定和分组取材于食管癌手术切除的正常食管黏膜组织，进行病理检验，仅选取病理诊断正常的标本进行细胞培养.标本获取经患者同意.标本采用无菌收集，保存于4℃无菌KSFM，4h内进行原代细胞培养，具体操作参照已有的方法［3］.获取的食管上皮细胞于KSFM（无血清培养液，含有BPE和rEGF）中，在37℃,50mL/LCO2条件下培养.第1次传代培养后进行CK14的免疫细胞化学染色鉴定细胞.实验组细胞于无BPE和rEGF的KSFM中同步化培养48h后，分别在6种胆酸溶液中培养3~60min.以正常培养液中培养的细胞为对照组.1.2

7、.2细胞增殖分析将细胞接种于96孔板，5×103细胞/孔.胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24h,.freelg/mL)，4h后弃去培养液，用100μL二甲基亚砜裂解细胞.于490nm测定吸光值，计算细胞增殖比，增殖比=实验组吸光值/对照组吸光值.1.2.3细胞周期观察将细胞接种于6孔板，5×105细胞/孔.胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤一次.每个样本约106个细胞，加入750mL/L冷乙醇固定4℃保存.以50μg/mL核糖核酸酶和50μg/mL碘化丙啶染色，流式细胞仪（FACSCalibur型，

8、美国BD公司）观察G1,S和G2相的细胞比率，以及细胞凋亡率.1.2.4磷酸化ERK1/2蛋白水平的测定采用APK通路主要有4条途径，ERK是其中研究得较为彻底的一条通路.ERK在所有的真核细