人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养

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1、人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养作者：张茹，龚均，王晖，王利，雷娟，冉力伟【关键词】细胞培养Isolationandsubcultureofhumanesophagealsquamousepithelialcells　　【Abstract】AIM:Toinvestigatetheoptimalmethodforthecultureofhighlypurifiedhumannormalesophagealepithelialcellsandtoyieldsignificantcellnumbers.METHODS:Cellswereisolat

2、edfromtissuesbydispasedigestionandtrypsinizationandthenprimarilyculturedandsubculturedinserumfreekeratinocytemedium(KSFM)orfetalbovineserum(FBS)supplementarymedium(KSFMwith100ml/LFBS).Thebiologicalcharacteristicsofthecellswereobservedthroughcellattachmentsandgrowthkineticcurvesa

3、ndwereconfirmedimmunohistochemicallyusingantihumanmonoclonalantibodyofthecytokeratin14(CK14),cytokeratin13(CK13)andvimentin.RESULTS:Fibroblastswerenotseeninallthecultures.Populationdoublingtime(PDT)inKSFMwas(51.5±11.5)h9(n=3),butitcouldnotbecalculatedinKSFMwith100ml/LFBS.Theadhe

4、rentcellssignificantlyincreasedinKSFM（P<0.01）.ThepercentagesofCK14positivecellsinKSFMweresignificantlyhigheratanycomparableperiods(P<0.05),butdecreasedwiththeprolongationofthegrowthtimeinthese2kindsofmedia.Contrarily,thepercentagesofCK13positivecellswerelowerandincreased.V

5、imentinwasnegativeinallthecultures.CONCLUSION:Tocultureandproliferatehumannormalesophagealsquamousepithelialcellsproductivelyinvitro,dispasedigestionandserumfreekeratinocytemediumarefeasibleandcrediblemethods.Serummayinducethedifferentiationofthesells.　　【Keywords】esophagus;epith

6、elialcells;cellculture　　【摘要】目的：探讨新的食管黏膜细胞的培养方法，以便能够获得大量细胞.方法：采用中性蛋白酶（Dispase）和胰酶先后消化从食管黏膜上分离上皮细胞，比较细胞在无血清培养基（KSFM）和含100ml/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性；采用细胞角蛋白14、13(CK14,CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞.结果：细胞倍增时间在KSFM中为（51.5±11.5）h(n=3)，而在含1009ml/L血清培养基中不能计算；在KSFM中，贴壁细胞明显为高（P<0.01）；CK14阳性细胞百分率K

7、SFM组在不同时段均高，但两组内均随生长时间增加而减少；CK13阳性细胞则恰与其相反；两组中均未见波形丝蛋白阳性表达.结论：Dispase消化分离细胞，KSFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.　　【关键词】食管；上皮细胞；细胞培养　　0引言　　目前食管黏膜的传代培养，就报道的极少的几种方法还存在着很多问题，比如大量的成纤维细胞污染［1］，不能传代扩增或传代次数较少［2］，细胞数量较少.我们通过改善原代取材时消化方法，进行含血清及不含血清培养基比较研究，探讨出能获得大量细胞的新的正常食管黏膜细胞的培养方法.　　1材料和方法　　1.1材料　　人角

8、朊细胞培养液（KSFM,Gibco），胰酶（Sigma）,DMEM(Hyclone),Disp