sphk1突变抑制高糖培养的系膜细胞纤维连接蛋白过度表达的研究

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1、SphK1突变抑制高糖培养的系膜细胞纤维连接蛋白过度表达的研究　　[提要]目的研究鞘氨醇激酶-1（SphK1）突变是否抑制了高糖培养的系膜细胞中纤维连接蛋白（FN）的过度表达。方法采用esangialcell，MC）是肾小球的主要功能细胞，无论在肾脏的生理功能还是病理变化中均发挥着重要的作用；现已认为MC主要参与了糖尿病肾病肾小球硬化损伤过程。FN是由系膜细胞产生的细胞外基质的重要成分之一，在糖尿病状态下，肾小球系膜细胞FN等细胞外基质的积聚，导致肾小球硬化、促进糖尿病肾病的病变进程[1]。鞘氨醇激酶（sphingosinekinase，SphK）是催化S

2、1P生成的关键限速酶[2]。我们前期研究表明：用四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠模型12周后，模型组小鼠在肾小球结构异常、肾功能降低的基础上，SphK1蛋白表达与活性较正常组相比明显升高；免疫组化结果显示，小鼠肾组织的SphK1主要表达于肾小球细胞，而模型组与正常组相比显著升高[3]，提示在糖尿病状态下SphK1的激活可能参与了糖尿病肾病的病变进程。本研究重点观察SphK1对细胞外基质主要成分-FN的调节作用，探讨糖尿病状态下高糖激活的SphK1对系膜细胞FN生成的具体分子机制。1材料与方法1.1肾小球系膜细胞原代培养采用逐级过筛法从SD大鼠的肾脏分离得到肾小球，用

3、完全培养基（DMEM+20%胎牛血清+胰岛素0.66U/mL+2mM谷氨酰胺+青霉素100U/mL+链霉素100μg/mL）约2滴，用吸管重悬肾小球，加入塑料培养瓶中，向各方向轻轻转动培养瓶，使含肾小球的细胞悬液均匀分布于瓶底，待细胞悬液近干时，然后迅速倒转培养瓶（使培养面朝上），加入约5mL完全培养液，放入CO2孵箱内培养，4h后，再轻轻将培养瓶翻转过来。待原代肾小球系膜细胞长满瓶底后，吸弃培养瓶内的培养基，用PBS冲洗培养瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化约1～3min，镜检发现细胞突起回缩，细胞间隙增大，或轻轻振动后绝大部分细胞悬浮、漂移，立即加入

4、含血清培养基终止消化，于1000rpm离心5min，传代培养基悬浮GMC至所需浓度，按1∶2比例传代培养。实验采用第3代到第15代之间的细胞。1.2质粒和瞬时转染空载体（Vector），突变型质粒（SphKG82D）由澳大利亚Dr.PuXia赠送。按照产品说明书采用Lipofectamine2000（Invitrogen）转染系膜细胞72h后收集细胞。1.3C的FN表达，MC分别转染空质粒Vector和突变型质粒SphKG82D。结果表明，高糖能明显上调FN的表达；转染了SphKG82D质粒后显著抑制了高糖诱导的FN表达，而转染Vector质粒无此效应，证

5、明SphK1参与了高糖诱导的FN表达。3讨论系膜细胞是肾脏的主要功能细胞，糖尿病状态下，肾小球系膜细胞FN等细胞外基质成分的积聚是导致肾小球硬化、促进糖尿病肾病病变形成的重要特征。因此，我们采用体外实验进一步探讨高糖环境下肾小球系膜细胞S1P信号通路的激活与细胞外基质成分FN生成的关联性，以明确高糖激活的S1P信号通路参与糖尿病肾病病理进程的作用机制。SphK1是催化S1P生成的关键酶[2，4，5]。研究表明：长期高血糖、AGEs、氧化应激等可激活SphK1，进而导致S1P的生成增加[6-9]。以往研究表明S1P在肾小球系膜疾病中起着重要作用[10-12]

6、。外源性S1P可显著促进GMC增殖[10-12]，导致肾脏疾病的发生。近年来，SphK1-S1P信号通路与包括糖尿病肾病在内的糖尿病性血管并发症的关系日益受到关注，成为相关领域研究的热点。慢性高血糖现被认为是糖尿病微血管及大血管病变的主要致病因素；血管内皮损伤是导致糖尿病慢性血管病变的起始环节[13]。研究发现，高血糖能够诱导内皮细胞SphK1的活化，参与了内皮损伤过程。同样在高糖培养的内皮细胞中SphK活性也有显著增加，采用siRNA技术证明高糖主要激活SphK16。高血糖状态下形成的AGEs现已证明是外周微血管病变的主要致病因素之一，导致糖尿病肾病和终

7、末期肾衰竭。Geoffroy等用AGEs处理GMC，发现当AGEs低浓度时，神经酰胺酶和鞘氨醇激酶活性明显升高，导致S1P积聚，诱使GMC增殖。Geoffroy随后观察了STZ诱导小鼠4d后肾脏中SphK1活性和S1P含量的变化，结果发现随着肾小球系膜细胞轻度增殖，肾脏中SphK1活性和S1P均显著增加，提示SphK1-S1P信号通路可能参与了糖尿病肾小球增殖过程[8，9]。本研究发现：在正常糖培养情况下，MC经过高糖培养后，FN的表达显著升高，而转染突变型质粒SphKG82D的MC，几乎完全抵消高糖诱导的MC中FN上调效应，提示高糖诱导的FN过度表达需要

8、SphK1的参与调节，为探寻将SphK1-S1P信号通路作为抗糖尿