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《sphk1突变抑制高糖培养系膜细胞纤维连接蛋白过度表达探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、SphKl突变抑制高糖培养系膜细胞纤维连接蛋白过度表达探究［提要］目的研究鞘氨醇激酶T(SphKl)突变是否抑制了高糖培养的系膜细胞中纤维连接蛋白(FN)的过度表达。方法采用Westernblot检测FN的表达。结果系膜细胞转染了SphKl突变质粒后可消除高糖诱导的FN上调效应。结论本研究结果证明了SphKl在高糖诱导的系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。［关键词］SphKl；纤维连接蛋白；系膜细胞［中图分类号］R587.2；R692.9［文献标识码］A［文章编号］1673-9701(2013)15-00
2、10-02系膜细胞(Mesangialcell,MC)是肾小球的主要功能细胞，无论在肾脏的生理功能还是病理变化中均发挥着重要的作用；现已认为MC主要参与了糖尿病肾病肾小球硬化损伤过程。FN是由系膜细胞产生的细胞外基质的重要成分之在糖尿病状态下，肾小球系膜细胞FN等细胞外基质的积聚，导致肾小球硬化、促进糖尿病肾病的病变进程［1］。鞘氨醇激酶(sphingosinekinase,SphK)是催化SIP生成的关键限速酶［2］。我们前期研究表明：用四氧囉噪诱导糖尿病小鼠模型12周后，模型组小鼠在肾小球结构异常、肾功能降低
3、的基础上，SphKl蛋白表达与活性较正常组相比明显升高；免疫组化结果显示，小鼠肾组织的SphKl主要表达于肾小球细胞，而模型组与正常组相比显著升高[3],提示在糖尿病状态下SphKl的激活可能参与了糖尿病肾病的病变进程。本研究重点观察SphKl对细胞外基质主要成分-FN的调节作用，探讨糖尿病状态下高糖激活的SphKl对系膜细胞FN生成的具体分子机制。1材料与方法1.1肾小球系膜细胞原代培养采用逐级过筛法从SD大鼠的肾脏分离得到肾小球，用完全培养基（DMEM+20%胎牛血清+胰岛素0.66U/mL+2mM谷氨酰胺+
4、青霉素100U/mL+链霉素100ng/mL）约2滴，用吸管重悬肾小球，加入塑料培养瓶中，向各方向轻轻转动培养瓶，使含肾小球的细胞悬液均匀分布于瓶底，待细胞悬液近干时，然后迅速倒转培养瓶（使培养面朝上），加入约5mL完全培养液，放入CO2孵箱内培养，4h后，再轻轻将培养瓶翻转过来。待原代肾小球系膜细胞长满瓶底后，吸弃培养瓶内的培养基，用PBS冲洗培养瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化约1〜3min,镜检发现细胞突起回缩，细胞间隙增大，或轻轻振动后绝大部分细胞悬浮、漂移，立即加入含血清培养基终止消化，于1000rpm离
5、心5min,传代培养基悬浮GMC至所需浓度，按1：2比例传代培养。实验采用第3代到第15代之间的细胞。1.2质粒和瞬时转染空载体(Vector),突变型质粒(SphKG82D)由澳大利亚Dr.PuXia赠送。按照产品说明书采用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染系膜细胞72h后收集细胞。1.3Westernblot细胞经裂解提取蛋白后，经SDS-PAGE电泳分离后，转膜至PVDFo采用5%的脱脂牛奶室温封闭lh,将一抗、二抗孵育后，采用增强型的化学发光液检测条带信号。膜重孵鼠单抗a-tu
6、bulin作为内参对照。1.4统计学分析数值采用均值土标准差表示。釆用单因素方差分析结合Bonferroni校正分析多组间的统计学差异，P[参考文献][1]RaptisAE,VibertiG.Pathogenesisofdiabeticnephropathy[J]・ExpClinEndocrinolDiabetes,2001,109Suppl2：S424-437.[2]TahaTA,HannunYA,ObeidLM.Sphingosinekinase：biochemicalandcellularregulatio
7、nandroleindisease[J].JBiochemMolBiol,2006,39(2)：113-131.[3]LanT,ShenX,LiuP,etal.BerberineamelioratesrenalinjuryindiabeticC57BL/6mice:InvolvementofsuppressionofSphK-SIPsignalingpathway[J].ArchBiochemBiophys,2010,502(2)：112-120._4]KohamaT,OliveraA,EdsallL,etal.
8、Molecularcloningandfunctionalcharacterizationofmurinesphingosinekinase[J]・JBiolChem,1998,273(37)：23722-23728.[5]MaceykaM,SankalaH,HaitNC,etal.SphKlandSphK2,sphingosinekinaseisoenzymeswith
