促甲状腺素受体膜外区(htshrecd)在大肠杆菌中的表达和纯化

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1、促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化【摘要】目的用大肠杆菌表达重组人促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)蛋白，为hTSHR膜外区的研究提供工具。方法从人甲状腺组织中提取总RNA，RTPCR分离得到TSHR膜外区cDNA，双酶切后插入原核表达载体pRSETC中,进行序列分析;再转化到表达菌BL21中表达、纯化、ethodsTotalRNAhumanthyroid,hTSHRECDcDNAidpRSETC，andexpressedinasolubleforminE.ColiBL21.ResultsThereolecularanTSHRECD;R

2、TPCR;purifyprotein　　促甲状腺激素（thyroidstimulatinghormone,TSH）是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，主要作用的靶器官是甲状腺，它与甲状腺细胞膜上特异的受体即促甲状腺激素受体(thyrotropinreceptor,TSHR)结合后，提高甲状腺的摄碘能力，并促进甲状腺激素的合成和释放，对甲状腺组织的生长、分化等起着非常重要的作用。在自身免疫性甲状腺疾病(autoimmunethyroiddisease,AITD)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropinreceptor,TSHR)是重要的自身抗原［1］，机体产生针对TSH

3、R的自身抗体(thyrotropinreceptorantibody,TRAb)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展TSHR的进一步研究。本研究从人甲状腺中提取RNA，通过逆转录获得TSHR膜外区cDNA，构建原核表达载体，成功表达和纯化高纯度人TSHR膜外区蛋白。　　1材料与方法　　1.1组织和实验材料　　　　甲状腺组织于已确诊的Graves手术患者。大肠杆菌DH5α和BL21购于北京鼎国生物技术有限公司;限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA连接酶及T克隆载体试剂盒pMD18T系日本TaKaRa产品;原核表达载体

4、pRSETc和Ni2+NTA悬液系美国Invitrogen公司产品;TotalRNAIsolationSystem、AccessRTPCRSystem、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和发光试剂盒为Promega公司产品;兔抗TSHR是上海亚培生物科技有限公司产品;质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。　　1.2PCR引物的设计合成　　根据文献报告人促甲状腺激素受体cDNA序列资料［2］，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增hTSHR膜外区cDNA编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′CAACTCGAGACCATGCTGGGCGGAATGGGGTGT

5、TCG3′，它包涵有转录启动子、Kozak系列和XhoⅠ酶切位点;下游引物为5′TACGAATTCCTACAGGAACTTGTAGCCCATTAT3′,它包涵有转录终止子和EcoRⅠ酶切位点。　　1.3总RNA的提取和RTPCR　　冻存的约100mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿异丙醇，抽提组织中的总RNA，经乙醇漂洗后溶于无RNA酶灭菌去离子水。利用分光光度器测定RNA的A260和A280值。RNA样品预处理于75℃变性5min后速放冰上冷却。RTPCR反应体系：AMV反转录酶(5u/μL)1μL，DNA聚合

6、酶(5u/μL)1μL，5×AMV/Buffer10μL，上下游引物各3μL，最后混合RNA样品加无RNA酶灭菌去离子水至50μL。混匀后置PCR仪上，逆转录反应条件设为：48℃逆转录60min，94℃预变性2min。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火60s，68℃延伸270s，45个循环后，68℃终延伸10min。对RTPCR产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。　　1.4克隆质粒和原核表达载体的构建及鉴定　　促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化根据TA克隆原理［3］,将TSHR膜外区片段插入pMD18T克隆载体。将TSHR膜外区(thyro

7、tropinreceptorectodomain,TSHRECD)片段3μL(约75ngDNA)，TA克隆载体1μL(约50ngDNA)，T4DNA连接酶0.5μL，10×连接酶缓冲液5μL，加去离子水至10μL，至PCR仪上16℃过夜。将连接产物转入DH5α细菌，经IGTP/Xgal平皿(Amp+)筛选，挑选单个阳性菌落，放入10mLLB培养液中，37℃振摇过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。将提纯的pMD18TETSHR重