盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定论文

《盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定论文陈健康张伟刘楠楠刘利兵田菲铁茹【摘要】目的：盘状结构域受体2（discoidindomainreceptor2,DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶，研究DDR2在类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用.方法：在毕赤酵母中表达DDR2胞外区片段（不含信号肽和跨膜区，命名为DR），并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定，以备将来用作DDR2的特异性阻断剂.结果：获得了两株较高表达HisDR融合蛋白

2、的毕赤酵母克隆；其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的18%；经NiNTA(nitrictriaceticacid)柱纯化后，获得了纯度约90%以上的可溶性HisDR融合蛋白；竞争结合抑制实验显示，HisDR具有阻断和细胞表面天然DDR2受体结合的功能.结论：所表达的融合蛋白HisDR具有抑制天然DDR2功能的作用.【关键词】盘状结构域受体2：胞外区；基因表达；阻断剂【Abstract】AIM:Toinvestigatetheroleofdiscoidindomainreceptor2(DDR2)in

3、thedestructionofcartilageinrheumatoidarthritis(RA)andtumormetastasis.METHODS:Dl8T载体连接，转化大肠杆菌后挑克隆酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送基康公司测序.1.2.3DR片段在pPIC3.5K载体中的亚克隆大量提取重组T载体质粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定.1.2.4重组载体的酵母电转化取10μL（约5μg）SalⅠ单酶切线性化的pPIC3.5Kd

4、dr2重组质粒与80μL酵母电转化感受态细胞混匀，转移于预冷的0.2cm电转化杯，冰浴5min.电转化后（参数为1500V,25μF,200Ω）立即加入500μL预冷的1mol/L山梨醇，混匀，铺于RDB板，30℃培养3~4d.以上过程同时做空载体对照.1.2.5多拷贝整合重组酵母的筛选用2mL的1mol/L山梨醇收集所有酵母重组菌落后混匀，分别取100~200μL铺于含G418分别为0,0.5,.freelg/mL的YPD板上，30℃培养3~4d.1.2.6重组酵母菌落的PCR鉴定挑含G418浓度较高的YPD板上的单

5、菌落于0.5mL离心管中，加10μL去离子水、5μL5U/μL的酵母消解酶混匀，30℃温育10min，再-70℃冻10min.冰融后作为PCR模板，PCR引物为pPIC3.5K载体多克隆位点两侧的引物：5′端为：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC3′；3′端为：5′GCAAATGGCATTCTGACATCC3′.PCR反应参数为：94℃30s；56℃1min；72℃90s，30个循环.1.2.7DDR2DR蛋白的酵母诱导表达及鉴定挑多拷贝重组酵母单菌落于30mL的MGY培养液中，30℃,250r/min培

6、养18h.室温2500r/min离心5min，菌体重悬于300mL的MM培养基中.30℃培养3d（期间每隔24h加甲醇至5g/L）后离心收菌，菌体沉淀用10mL裂解液重悬后，加入等体积的酸洗玻璃珠剧烈振荡30s；冰浴30s，重复8次.4℃高速离心10min，上清为裂菌液.取15μL裂菌液进行SDSPAGE和Dl8T载体连接，酶切鉴定后，对其中一个阳性克隆进行测序，并将序列在GenBank中进行分析，结果显示，序列完全正确.图1显示，PCR产物和重组pMDl8T载体酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果.2.2重组酵母表达载

7、体pPIC3.5KDR的构建及鉴定大量提取重组pMDl8T载体质粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定.图2显示，重组pPIC3.5KDR载体的琼脂糖凝胶电泳结果.2.3重组酵母菌的筛选和PCR鉴定酵母电转化后每个RBD板上约长出5×103个His阳性单菌落，G418浓度筛选最高为4.0mg/mL，根据同源重组一个载体约抵抗0.25mg/mLG418估算，同源重组入同一酵母菌的pPIC3.5Kddrg2串联拷贝数最高可达到15个

8、以上.图3显示，重组酵母菌的PCR鉴定结果.2.4DR蛋白的表达和鉴定对PCR鉴定后的3号和4号重组菌进行目的蛋白质的诱导表达，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，3,4号阳性克隆细菌在约46ku处均有一新生表达条带（HisDR），与目的蛋白质大小相符（图4）.根据薄层扫描结果分析，上清中的新生蛋白质约占融合蛋白质总量的18％.MP