PICK1及其结构域的表达-纯化和部分功能.doc

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1、PICK1及其结构域的表达，纯化和部分功能PICK1及其结构域的表达，纯化和部分功能PICK1及其结构域的表达，纯化和部分功能【摘要】：蛋白激酶Cα相互作用蛋白(proteininteractingwithCαkinase，PICK1)是蛋白激酶Cα(proteinkinaseCα，PKCα)的靶蛋白之一，也是衔接PKCα和膜上众多受体的关键蛋白之一。PICK1在人和动物的细胞或组织内均可表达，以大脑和睾丸中表达最高，肺中最低。在许多细胞中，PICK1一般存在于细胞质中，常富集于核周区，且是不对称分布，多半是在靠近粗面内质网和高尔基体。小鼠来源的PICK1由416氨基酸残基

2、组成，在其N-端含有PDZ结构域(PSD95DiscslargeandZol)，C端区域为一个BAR结构域(Bin／amphiphysin／RVS)，靠近C末端又含一个酸性氨基酸区。PICK1蛋白的结构是非常独特的，目前在NCBI数据库中未发现类似的同时含PDZ结构域和BAR结构域的蛋白。已报道的PICK1的配体的作用区大多集中在其PDZ结构域部分，该结构域和受体蛋白、转运蛋白、衔接蛋白均有相互作用。BAR结构域参与了和GRIP蛋白以及膜的结合。然而，PICK1和这些膜蛋白的相互作用的作用机理与生物学意义还不是很清楚。本研究对PICK1蛋白及其BAR结构域和PDZ结构域分别

3、进行了基因克隆和表达以及产物纯化，并对其部分理化性质进行研究。根据报道的PICK1基因序列，设计PCR引物，以重组质粒pRK5-pick1为模板，经PCR扩增获得PICK1基因，克隆到pET32M和pGEX-6p-1载体中，并在E．coliBL21中进行表达。重组子pET-pick1表达产物为不溶性包涵体，而重组子pG-pick1表达产物为可溶性融合蛋白GST-PICK1，经GST-Sepharose4B亲和层析和PreScissionProtease(PPase)蛋白酶切割，以及SephacrylS-200凝胶层析等，获得了游离的电泳纯PICK1蛋白，经SDS-PAGE分

4、析，其单体分子量约为50kDa。分子排阻层析和天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，重组PICK1蛋白在溶液中主要以二聚体形式存在，分子量约为103kDa。鉴于PICK1分子含有一个色氨酸残基，我们通过荧光实验初步分析了PICK1蛋白与钙离子的结合特性，随着Ca_(2+)浓度的增加，PICK1的内源荧光强度逐渐下降，经计算Ca_(2+)与PICK1的结合比为2：1，因此PICK1蛋白和钙离子之间有结合作用。将BAR(128-360aa)结构域基因读框克隆到含不同启动子的表达载体中(pE32M，pGEX-6P-1，pHGB，pMAL-p2X)中，并在E．coliBL21(pE-ba

5、r，pG-bar，pH-bar)或E．coliJM109(pM-bar)中进行表达，目的蛋白大多数以不溶性包涵体形式表达，只有pM-bar在E．coliJM109中获得可溶性表达产物MBP-BAR，表达量可达到细胞总蛋白的30％。但由于FactorXa蛋白酶价格昂贵，且对MBP-BAR的酶切效果不理想，我们将pMAL-p2X载体中编码识别FactorXa蛋白水解酶的位点替换为识别PPase酶切位点，构建的修饰载体为pMAL-s。然后截取除PDZ结构域外的不同长短的编码序列(含BAR基因)克隆到新载体pMAL-s中进行表达，并比较了PPase对MBP的拆除效率、酶切后的游离B

6、AR结构域的稳定性以及相应工程菌生长状况等因素，最终选择BARc(128-416aa)(以下简称BARc)进一步制备不含亲和臂的游离BARc样品。酶切后的MBP和BARc蛋白混合物，经1mol／L(NH_4)_2SO_4沉淀，MBP蛋白留在(NH_4)_28O_4上清中，而BARc沉淀析出得以分离。重新溶解的BARc结构域，经SDS-PAGE分析，其纯度达95％左右。利用Pre-packedSepharose12分子排阻层析BARc洗脱的保留体积处于空体积(Voidvolume)范围，表明BARc为多聚物。以牛脑的脂类提取物作为基质，利用蛋白质-脂类覆盖法(ProteinL

7、ipidOverlayassay，PLO)研究游离的BARc与脂类的相互作用，表明BARc结构域与脂类存在特异性结合。同时CD谱也揭示随着脂类加入会引起BARc蛋白的α螺旋含量的增加，也证实BARc结构域是和脂类的结合作用区域。BARc中包含有酸性氨基酸区域，因此Ca~(2+)对BARc与脂类的相互作用的调节也进行了初步分析。CD结果表明，1mmol／LCa~(2+)浓度可增加BARc的随机折叠但不会影响其α-螺旋，而当Ca~(2+)和牛脑脂类提取物同时加入到BARc结构域的溶液中时，BARc的螺旋成分随之增加。可