shp2酪氨酸磷酸酶csh2结构域的表达纯化和nmr研究

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1、浙江理工人学学报，第26卷，第4期,2009年7月JournalofZhejiangSci-TechUniversityVol.26，No.4,Jul.2009文章编号:1673-3851(2009)04-0602-06SHP-2酪氨酸磷酸酶C-SH2结构域的表达纯化和NMR研究李少飞，郭江峰，丁先锋(浙江理工人学生命科学院,杭州310018)摘耍:SHP-2足一种非跨脱型蛋0酪氨酸磷酸酶。将KN末端结构域C-SH2克隆至原核衣达载体pGEX-2T屮，命名为pGEX-2T-C-SH2。该融合蛋內在人肠杆谢屮以可溶形式表达于谢体上淸液屮，经G

2、ST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后，目的蛋A纯度可达98%。质谱分析表明，U的蛋A相对分子尕与理论值基本扣同。在敁适表达条件下，1L的M9培养基能够高效表达并获得12mgC-SH2蛋白，NMR结构和活性位点的分析表明，目的蛋闩能正确折呑并呈规则的空M结构。关键词:SHP-2;C-SH2:蛋白纯化洞位素标记;NMR;HSQC屮阁分类兮:Q78文献秘I只码:A0引言SHP-2属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员之一，作为细胞闪子、生biw子及真它胞外刺激W索的卜'游倍号分子，表达于机体的各种组织和细胞中，勾细胞塯殖、分化、转移、死亡等重要的生命活动

3、密切相关［1_3］。SHP-2足由PTPN11基因所编码的，真N末端前后含有两个SH2结构域N-SH2(3—104)和C-SH2(112—216)，C末端含有一个具有催化活性的PTP结构域(221—524＞及富含脯氨酸基团和酪氨酸磷酸化位点的木端［4］。Hof等［41用X-射线研究了SHP-2结构(1一527)，但仍有部分肽段结构尚未解析出来，也括156—160、236—245、295—301和313—323。Ugochukwu等［5】M样用X-射线研究了易受影响的SHP-2结构(237—529),295—301结构解析出來，但足236—2

4、45和313—323结构还是受影响。X-肘线不容易测定一些松动结构区域的三维结构，促是用NMR可以在较短的时间内把易受影响的结构区域解析出来［^。以前研究重点足N-SH2，近年來发现C-SH2可能发挥重要作川。C-SH2在A身未磷酸化的怙况下，可能募集SHP-2到细胞表而受体［4’8］。C-SH2可能通过C末端的66个氨基酸來调控PTP结构域。C-SH2可能慕集SHP-2聚粜在磷酸化配体周围，増人N-SH2与磷酸化配体的结合机会，使蛋白构象变化并激活该酶［9］。C-SH2增强了信号转导过程的专-•性和特异性［9_WI◊大量的研究表明，SHP

5、-2屮C-SH2结构域突变后，磷酸化酪氨酸残基pY不能与其结合，从而不能暴露出PTP结构域的活性催化位点，抑制该酶活性并肌碍信兮转导级联反应，但对于其生物学作用及多种致病机制仍需作更深入丫解。SH2突变与Noonan综合征［1V12］,急性白血痫［13'141，胃癌115'161，肺腺瘤，黑素瘤等疾病的关系还不明确，使其难以应用于临床诊断和治疗。因此，对SH2的结构和功能的研究具有重要意义。本研究将C-SH2H的基因插入到PGEX-2T表达载体，表达出GST融合蛋白，通过GST亲和层析柱纯化后，用NMR对C-SH2蛋门进行初步结构分析，为进

6、一步研究其结构和功能;奠定基础。收稿H期:2009-01-07作者简介:李少飞(1983-),男，山东烟台人，硕士研究生，主耍从事分子生物学研究。?1994-2015ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.Iittp://w

7、l(NewEnglandBiolabs产品)，PCR产物纯化试剂盒(Axygen公司产品)，蛋A定fi试剂盒(江苏碧云天生物科技公司产品)，GST亲和层析柱(GenScript产品)，凝血酶(Sigma产品)，Sephadex75HP填料(北京韦氏博慧色i普科技竹限公司产品)，其他常规试剂均为进U分装或国产分析纯。1.2熏组质粒pGEX-2T-C-SH2的构建1.2.1引物设计根据SHP-2伞长DNA汴列(GenBank号:L03535),设计合成特异的上游引物和下游引物，扩增C-SH2基W,为方便兑隆，上游引物的5’端引入了BamHI酶切

8、位点，下游引物的5*端引入了EcoRI酶切位点，上游引物为5*-AGCCGGATCCTGGTTTCATGGACATC-3*,下游引物为5’-AGCCGAATTCTAAGTTA-A