盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定

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1、盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定【摘要】目的：盘状结构域受体2（discoidindomainreceptor2,DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶，研究DDR2在类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用.方法：在毕赤酵母中表达DDR2胞外区片段（不含信号肽和跨膜区，命名为DR），并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定，以备将来用作DDR2的特异性阻断剂.结果：获得了两株较高表达HisDR融合蛋白的毕赤酵母克隆；其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的18%；经NiNTA(

2、nitrictriaceticacid)柱纯化后，获得了纯度约90%以上的可溶性HisDR融合蛋白；竞争结合抑制实验显示，HisDR具有阻断和细胞表面天然DDR2受体结合的功能.结论：所表达的融合蛋白HisDR具有抑制天然DDR2功能的作用.【关键词】盘状结构域受体2：胞外区；基因表达；阻断剂　　【Abstract】AIM:Toinvestigatetheroleofdiscoidindomainreceptor2(DDR2)inthedestructionofcartilageinrheumatoidarthritis(RA)andtumormetasta

3、sis.METHODS:MP1的表达［8］.为了研究DR2在肿瘤转移和类风湿性关节炎中的作用，DDR2特异性阻断剂将是一个有力的工具.但由于DDR2是一种比较新的分子，目前对它的研究又不多，所以尚无特异性的受体阻断剂.可溶性受体作为特异性受体阻断剂已被广泛应用于多种受体的功能研究．甚至作为抑制剂进入临床治疗.其机理是在细胞外，外源的模拟受体分子由于与天然受体结构相同而竞争性地与相应配体结合，从而阻断了配体与天然受体的结合，也就抑制了配体和受体相应的功能.　　　　我们采用此策略对DDR2胞外区用毕赤酵母系统进行了表达.为了增加蛋白质的可溶性，选择了融合表达方式：采用p

4、PIC3.5K载体，表达His融合蛋白.融合蛋白经纯化后，通过竞争抑制实验验证其是否阻断配体II型胶原与细胞表面DDR2的结合，通过细胞实验验证其是否抑制II型胶原刺激下的细胞MMPl的分泌.　　1材料和方法　　1.1材料　　重组质粒pRsetAddrg2由本室构建；pPIC3.5K酵母表达载体、酵母GS115菌种、氨基酸混合物、大肠杆菌E.coliTop10F购自invitrogen公司；酵母氮碱（YNB）、酵母消解酶、酸洗玻璃珠、Ta公司产品；山梨醇、胶回收和质粒提取试剂盒为上海华舜生物技术公司产品；鼠抗6HismAb,NTA亲合介质购于Qiagen公司；

5、HRP标记的羊抗鼠二抗购自SantaCruzBiotechnology公司；Dl8T载体连接，转化大肠杆菌后挑克隆酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送基康公司测序.　　1.2.3DR片段在pPIC3.5K载体中的亚克隆大量提取重组T载体质粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定.　　1.2.4重组载体的酵母电转化取10μL（约5μg）SalⅠ单酶切线性化的pPIC3.5Kddr2重组质粒与80μL酵母电转化感受态细胞混匀，转移于预冷的0.2cm电转化杯，冰浴5min.电转化后（参数为1500

6、V,25μF,200Ω）立即加入500μL预冷的1mol/L山梨醇，混匀，铺于RDB板，30℃培养3~4d.以上过程同时做空载体对照.1.2.5多拷贝整合重组酵母的筛选用2mL的1mol/L山梨醇收集所有酵母重组菌落后混匀，分别取100~200μL铺于含G418分别为0,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,2.5,3,4,5mg/mL的YPD板上，30℃培养3~4d.　　1.2.6重组酵母菌落的PCR鉴定挑含G418浓度较高的YPD板上的单菌落于0.5mL离心管中，加10μL去离子水、5μL5U/μL的酵母消解酶混匀，30℃温育10min，再-70℃冻10min

7、.冰融后作为PCR模板，PCR引物为pPIC3.5K载体多克隆位点两侧的引物：5′端为：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC3′；3′端为：5′GCAAATGGCATTCTGACATCC3′.PCR反应参数为：94℃30s；56℃1min；72℃90s，30个循环.　　1.2.7DDR2DR蛋白的酵母诱导表达及鉴定挑多拷贝重组酵母单菌落于30mL的MGY培养液中，30℃,250r/min培养18h.室温2500r/min离心5min，菌体重悬于300mL的MM培养基中.30℃培养3d（期间每隔24h加甲醇至5g/L）后离心收菌，菌体沉淀用