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《pkb-akt 调节结构域的克隆，表达及初步纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、PKB/Akt调节结构域的克隆，表达及初步纯化：王立峰，张健，李莹，苏金，药立波，刘新平【关键词】基因表达 【Abstract】AIM:ToclonethecodingsequencesofhumanRD(regulationdomainofPKB/Akt),toexpressthecorrespondingproteinandtogetthepurifiedprotein.METHODS：TheRDcDNA(regulationdomainofPKB/Akt)fragmentplifiedusingPCRinfet
2、alhepatocytes.ThePCRproductedbyparisonnbyvirtueofthe(His)6tagontheprotein.CONCLUSION：HumanRDofakt1genehasbeensuccessfullyclonedandRD/6×Hisrebinantplasmidconstructed.RD/6×HisfusionproteinhasbeencorrectlyexpressedinE.coliandthesolublefusionproteinpurifiedbyNi2NTAa
3、garosebeads. 【Keyolecular;geneexpression;purification 【摘要】目的：克隆akt1的调节结构域(regulationdomainRD)的编码基因，表达并纯化AktRD蛋白，为研究RD的功能奠定基础.方法：用RTPCR方法从胚胎肝细胞中获得Akt1调节结构域RD的编码基因，克隆至pMD18T载体并测序，结果正确后亚克隆到含有6个His的融合表达载体pRSETA中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达RD/6×His融合蛋白，超声裂菌，将上清通过金属螯合
4、层析进行纯化.结果：从人胚胎肝细胞中扩增出编码RD的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致；成功构建了6×His融合的表达载体pRSETARD；表达了RD/6×His融合蛋白，并纯化得到了RD/6×His蛋白.结论：成功克隆了人akt1的调节结构域RD基因，构建了6×His融合的表达载体,表达了RD/6×His融合蛋白并得到了纯化的RD/6×His蛋白. 【关键词】PKB/Akt；克隆,分子；基因表达；纯化 0引言 PKB/Akt分子由三部分组成，第一部分为N端的pH结构域，第二部分为中间的催化结构域，第三部
5、分为C端的调节结构域（regulationdomain,RD）［１－３］.PKB/Akt参与某些生长因子或淋巴因子诱导的靶细胞应答，影响胞内糖类的转运、糖原的合成及蛋白质的合成，抑制细胞凋亡等，是机体维持正常生命活动的一个重要调节分子［４］.PKB/Akt催化结构域中的Thr308和调节结构域中的Ser473都发生磷酸化后，使其活性被激活，进而调节下游分子，执行相应功能［５］.调节结构域中的Ser473的磷酸化对PKB/akt发挥最大活性至关重要［６］.催化结构域的Thr308的磷酸化是由上游的PDK1催化的［７，８］
6、，而使位于调节结构区的Ser473发生磷酸化的激酶（即人为设想的PDK2）至今未找到明确的分子［９］.因此，克隆并纯化得到PKB/Akt的调节结构域，将为寻找PDK2分子及研究PKB/Akt分子的调节结构域对整个分子的调节作用奠定实验基础. 1材料和方法 1．1材料T4DNA连接酶购自TaKaRaBiotech公司；EcoRI,NheI限制性内切酶购自晶美生物工程有限公司；AMV反转录酶购自Promega公司；pRSETA载体购自Invitrogen公司；金属螯合亲合层析中所用Ni2+NTA琼脂糖介质购自Qlage
7、n公司；大肠杆菌BL21由本室冻存；异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）购自华美公司；Akt单抗购自Cellsignal公司；HRP标记的兔抗鼠二抗购自SantaCruzBiotecknology；V逆转录酶合成第一条链cDNA.具体反应体系为：总RNA1μg与Oligo(dT)152μL,70℃,10min,然后加入5×RTBuffer5μL,dNTP(10mmol)2.5μL,RNaseinhibiter1μL,AMV逆转录酶3μL,DEPC水9.5μL.42℃水浴1h,沸水浴5min，-20℃保存.取1μL逆转录产物为
8、模板，在25μL反应体系中先将模板于95℃变性5min，加入16.67nkatTaqDNA聚合酶，在PE2400PCR循环仪中反应.循环参数：94℃30s,60℃40s,72℃30s,30cycles，于72℃延伸15min.用12g・L１琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物. 1．2.4DNA序列测定PCR扩增产物用上海
