prongf在大肠杆菌中表达、纯化和复性的研究

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1、摘要神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，其生理作用十分广泛，尤其在促进神经元的生长、发育、分化与成熟、维持神经元的存活与损伤修复及再生等方面发挥着重要作用，它还参与免疫反应，并具有促进伤口愈合和血细胞生长，抑制肿瘤生长等作用。NGF在人体组织中含量极微，已有报导从胎盘中纯化hNGF，但其组织来源极其有限，成本高产量低，不能满足科研和临床的需要，所以利用基因工程方法获得大量有生物学活性的NGF蛋白，对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。目前，国内已有研究者尝试在不同的表达系统中进行重组表达，

2、但是在表达产物中很难获得活性较高的二聚体形式的蛋白。由于目前发现的绝大部分的以含前导肽的前体形式合成的蛋白质，其前导肽都有帮助其正确折叠的作用，所以本研究对含前导肽的人NGF基因(proNGF)在大肠杆菌中进行了表达，并以此来探讨NGF前导肽在辅助成熟肽的折叠及二硫键的配对过程中的作用。本论文的主要研究工作和结果如下：L以pFastBac．preproNGF为模板，根据Genbank上提供的人NGF的基因序列和试验需要设计出特异的引物，在目的蛋白基因的上游引入编码肠激酶识别序列的碱基和NdeI酶切位点，用PCR的方法扩增出含前导肽的人NGF基因(pr

3、oNGF)并克隆到pBS．T载体，对所构建的重组子pBS-T-proNGF进行分析鉴定。2．把克隆的proNGF基因插入大肠杆菌表达载体pETl5b中，构建重组表达质粒pETl5b．proNGF，将分析鉴定正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS·3．用Immol／LIPTG诱导转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，表达菌经超声破碎后离心，上清和沉淀分别进行SDS．PAGE电泳检测，目的蛋白以包涵体的形式存在，融合蛋白分子量大小约为30．2kDa，表达量占全菌总蛋白量的19．2％。摘要4．表达产物的Western印迹鉴定结果显示，重

4、组proNGF与兔抗人[3-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应，在30kDa处出现单一的条带，表明诱导表达的重组proNGF具有免疫学活性。5．通过镍柱亲合层析纯化和肠激酶切割得到了proNGF蛋白，分子量为27kDa。用Bradford法测定蛋白质浓度，经计算，从100mL表达菌中可得到13．1mgproNGF蛋白。6．将纯化后的proNGF在氧化还原环境下进行透析复性，RP．HPLC法对复性结果进行检测，通过与标样保留时间的对比确定了已复性的成份，7．对影响复性的环境因子进行初步的研究，RP．HPLC外标法对复性结果进行定量分析，计算出不同条件

5、下的复性率。8．PCI2细胞活性鉴定试验显示，proNGF能诱导PCI2细胞分化，出现神经突触样生长，表明透析复性后的proNGF具有良好的生物学活性。关键词：神经生长因子前导肽包涵体蛋白折叠PCI2细胞nAbstractNervegrowthfactorisoneofthemostimportantfactors、Ⅳi也biologicalactivity,playingallimportantroleinregulatingthegrowth,development,andsurvivaloftheneuronbutalsototheregene

6、rationandtherehabilitationofthescathednervecells．ItCallkeepthebalanceofthesystemsofneural，endocrineandimmunity．TheleveloftheNGFinhumanbedyisverylow．FromthereportaboutthepurifiedNGFfromhumanplacenta,thetissuefromwhichwecallisolatetheNGF嘶血biologicalaetivityisverylimited,butalsoit

7、sproductistoolowtomeettheneexlsoftheNGFforpeople．SoithasgreatsignificancetoisolateNGFwithnativestructureandbiologicalactivitybygeneticengineeringforitstheoryresearchandclinicapplicationRecombinanthumannl目t．vegrowthfactorhasbeenproducedindifferentexpressionsystem,buttherecombina

8、ntpreparationsappeartobelessactivethannaturallyoccurri