重组大肠杆菌表达包涵体药物蛋白的复性与纯化研究

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1、华东巧工大学硕±学位论文第Ｉ页重组大肠杆菌表达包涵体药物蛋白的复性与纯化研究摘要大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的重组蛋白表达系统。由于蛋白表达速度过快、活性二硫键来不及正确配对等等原因，外源蛋白在大肠杆菌胞内往往会Ｗ无活性的包涵体形式表达。由于包涵体复性折叠机制不明确，把无活性的包涵体复性为完全的天然活性状态是一件很难的事情。较低的复性效率也仍然是大肠杆菌体系表达的许多外源蛋白造成损失或者难有效制备的主要原因。本课题重组人表皮生长因子（ｈＥＧＦ）和新型ＨＩＶ疫苗蛋白为研究对象，研究在包涵体药物蛋白的复性纯化过程中如何根据具体目的和要求，决定复性与纯化

2、的先后顺序、选择复性方法和纯化方法、合理设计纯化方案（合理衔接不同的纯化方法）等等，期为其他包涵体药物蛋白的复性纯化提供一定的参考价值。＂＂非融合表达旭ＧＦ蛋白的复性纯化研究：采用的是先复性后纯化的策略。经过一＾＾％不断探索，最终确定此ＧＦ蛋白的复性纯化工艺为：包涵体洗涂包涵体变、复性５０硫按沉淀一＾ＤＥＡＥ阴离子交换层析－凝胶过滤层析。ｈＥＧＦ纯化样晶的ＳＤＳＰＡＧＥ电泳纯度为９７％，ＨＰＬＣ液相色谱纯度为９６％８；蛋白纯化回收率为１％；且此纯化样品对Ｂａｌｂ／ｃ３巧细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）具有明显的生长促进作用。一Ｈ新型的药物蛋白ＩＶ辅助Ｔ细胞疫苗的复性

3、纯化研究：（１）ＨＩＶ疫苗包涵体蛋白的变性条件优化。包涵体蛋白先用７Ｍ盐酸脈变性缓冲液变性溶解，接着用８Ｍ尿素缓冲液对其进行稀释，使盐酸脈浓度降至１Ｍ。如此变性处理后的包涵体蛋白结构更趋于。（稳定，后期纯化及复性过程中都不会发生蛋白沉聚现象２）ＨＩＶ疫苗包涵体蛋白的纯＂＂化与复性一。选择先纯化后复性的策略，研究出套成熟的复性纯化工艺：包涵体洗絡一包涵体变性一镇柱亲和层析（ＨｉｓＴｒａｐＦＦ）一３０％硫镑沉淀一ＣＭＦＦ阳离子交换层析一镶柱亲和层析（ＨｉｓＴｒａｐＨＰ）。最后目的蛋白的电泳纯度提高到％％。ＨＩＶ疫苗包涵体蛋白的纯化总回收率为１３％。纯化后的变

4、性状态的包涵体蛋白复性方法选择透析复性ＨＩＶ一，复性过程中没有产生明显的蛋白沉淀。疫苗蛋白的成功复性分离纯化为进步研究Ｈ。ＩＶ辅助Ｔ细胞疫苗蛋白的理化性质Ｗ及生物学功能提供了保障关键词：大肠巧菌；药物蛋白；包涵体；复性纯化；第ＩＩ页华东理工大学硕±学位论文ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＲｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎＥｘｒｅｓｓｅｄａｓＸｎｃｈｉｓｉｏｎＢｏｄｉｎ民ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ反ｃｏ／／ｐｙ乂ｂｓ化ａｃｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｓｙｓ１：ｅｍｉｓｓｔｉｌｌｔ

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