大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化.ppt

《大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化创新实验I-化学生物学<化学生物学实验>课程组王骊丽实验四NORTHWESTUNIVERSITY化学国家级实验教学示范中心基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。重组蛋白分离纯化：细胞收集、破碎；包涵体的溶解；蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法；蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法实验技能训练要点主要新知识仪器分析：色谱技术–液相色谱技术……仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振……化学生物学导论：蛋白质、酶……

2、蛋白质与酶化学：重组DNA技术……蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征…..有机化学：荧光探针实验技能训练要点主要知识回顾背景知识实验室研发从E.coli中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品，包括以下步骤：①目的基因DNA片段的获得；②E.coli重组表达载体的构建；③在E.coli中对目的基因进行表达；④目的蛋白从E.coli裂解液中的纯化；⑤规模化生产工艺（包括工程菌发酵、复性与纯化工艺的放大等）的建立。关键词：重组人粒细胞-集落刺激因子、液相色谱复性与纯化Recombinanthuma

3、ngranulocytecolonystimulatingfactor,Renaturationandpurificationbyliquidchromatography实例：粒细胞白血病粒细胞白血病(ML)在我国其发病率占成人新诊断白血病20%以上，年发病率为10万分之1。人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用HSCCLPCMPGMPMEPPro-TPro-BTBNK单核细胞粒细胞巨核细胞红细胞SCF;IL-2SCFEPOSCFSCFSCFSCFIFN-SCF基质细胞SCF名称氨基酸残基数二硫键数相对分子质

4、量与等电点主要产生细胞主要生物学rhG-SCF177分子中含有5个半胱氨酸残基，可形成两个二硫键19.6kD;pI6.0巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞能高度特异性的刺激中性白细胞系的前体细胞存活、增殖和分化，同时也是成熟的中性白细胞的功能活化因子rhG-CSF的理化性能与生物学功能复性与纯化方法添加剂质量回收率(%)纯度(%)生物活性(×108IU/mg)IEC3.0mol/Lurea,2.5mmol/LGSH,0.8mmol/LGSSG49.0963.0HICN.R.42.696.82.1SEC15%glycer

5、ol(v/v),2.5mmol/LGSH,0.8mMGSSG30.0831.2脲梯度SEC15%glycerol(v/v),2.5mmol/LGSH,0.8mmol/LGSSG46.1N.R1.0AFC2.0mol/Lurea32.0971.8AFC3.0mol/Lurea39.0972.3几种PFLC法复性与纯化rhG-CSF包涵体结果比较西北大学化学与材料科学学院实验内容提要一、实验目的二、实验原理三、实验仪器与试剂六、实验延伸五、实验结果与讨论四、实验步骤与方法思考题参考文献一、实验目的掌握包涵体的变性、复性

6、的基本原理；熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法；熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。通过人粒细胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因扩增和在大肠杆菌DH5α中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特点;了解二硫键形成与构象的关系；基因工程技术是指人们按照自己的愿望，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物物种，使现有物种出现人类需要的性状的技术;以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术，使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。二、实验原

7、理--基因工程技术大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在；包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性；包涵体能够溶解于强的变性剂，如8mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。二、实验原理—包涵体的形成和特点超声破碎包含体外周质胞浆沉淀可溶部分洗涤溶解离心离心包涵体复性直接稀释法（Directdilution），包括透析法和超滤法液相色谱复性法（Chromatographicmethodsforproteinrefol

8、ding）人工配基辅助的蛋白复性（Artificialmolecularchaperoneassistedproteinrefolding)二、实验原理—体外复性的主要途径液相色谱复性蛋白的过程蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。西北大学化学与材料科学学院三、实验试剂和仪器