人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

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1、人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达作者：李雪萍，施秉银，武敏，伍丽萍，刘陕西【摘要】目的克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因，构建重组真核表达质粒，获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白。方法应用RTPCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA，插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RTPCR鉴定基因转录，用免疫细胞化学染色法和WesternBlot鉴定表达蛋白。结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因，表达蛋白具有免疫活性。结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核

2、细胞中成功表达。【关键词】自身免疫性甲状腺疾病;人促甲状腺素受体;基因重组;真核表达ABSTRACT:ObjectiveTocloneandconstructtheplasmidcontaininghumanthyroidstimulatinghormonereceptor(TSHR)geneectodomain,andthenidentifytheimmunoreactivityofthepurifiedrecombinantprotein.MethodsTSHRtotalRNAwasextractedfromhumanthyroid,andc

3、DNAwasobtainedwithRTPCRtechnique.HumanTSHRectodomaingene(hETSHR)wascloned12intopcDNA3.1(+)vector.TherecombinedconstructwastransfectedintoCHOcellsbyLipofectin2000.ThetranscriptmRNAwasdetectedbyRTPCR,andproteinimmunoreactivitywasassayedbyTSHRantibodywithimmunocytochemistrysta

4、iningandWesternblot.ResultsDNAsequencingresultsshowedthattherecombinantofhumanthyrotropinreceptorectodomainhadconfirmedsequencereportedinGenBank.Thefusionproteinhadtheimmunoreactivity.ConclusionHumanthyroidstimulatinghormonereceptorwassuccessfullyclonedineukaryoticexpressionv

5、ectorandtheconstructorwasexpressedineukaryoticcellsverywell.　　KEYWORDS:autoimmunethyroiddisease;humanthyroidstimulatinghormonereceptor;generecombination;eukaryoticexpression　　人促甲状腺素受体(thyroidstimulatinghormonereceptor,TSHR)存在于甲状腺细胞膜上，对甲状腺正常生长、发育及功能维持发挥着重要作用，同时也是自身免疫性甲状腺疾病(aut

6、oimmunethyroiddisease,AITD)最重要的自身抗原[1]。机体产生针对TSHR的自身抗体(thyroidreceptorantibody,12TRAb)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展TSHR的进一步研究。本文从人甲状腺中提取RNA，通过逆转录获得TSHR膜外区cDNA，构建真核表达载体，体外表达了TSHR蛋白，为进一步建立新的AITD自身抗体检测方法、建立AITD动物模型等奠定了基础。　　1材料与方法　　1.1材料甲状腺组织取自患者手术过程切除的甲状腺组织。RT

7、PCR试剂盒购自美国Promega公司。PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒购于上海博亚生物技术公司。pMD18T载体、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及DNA连接试剂盒购自TaKaRa公司。真核表达载体pcDNA3.1(+)、RNA提取Trizol试剂盒、阳离子脂质体LipofectinReagent2000、细胞培养液、抗生素G418购自Invitrogen公司。鼠抗人TSHR单克隆抗体、Actin抗体购自ABCAM公司。免疫细胞化学染色试剂盒购自美国Vector公司。Westernblot用BIORAD电转膜仪。中国仓

8、鼠卵细胞(Chinesehamsteroocyte,CHO)由第四军医大学生物技术中心提供。RTPCR检测hETSHRmRNA在CHO