促甲状腺素受体膜外区(htshrecd)在大肠杆菌中的表达和纯化论文

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1、促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化论文【摘要】目的用大肠杆菌表达重组人促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)蛋白，为hTSHR膜外区的研究提供工具。方法从人甲状腺组织中提取总RNA，RTPCR分离得到TSHR膜外区cDNA，双酶切后插入原核表达载体pRSETC中,进行序列分析;再转化到表达菌BL21中表达、纯化、ethodsTotalRNAhumanthyroid,hTSHRECDcDNAidpRSETC，andexpressedinasolubleforminE.ColiBL21.ResultsThereolecularanTSHRECD;RT

2、PCR;purifyprotein促甲状腺激素（thyroidstimulatinghormone,TSH）是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，主要作用的靶器官是甲状腺，它与甲状腺细胞膜上特异的受体即促甲状腺激素受体(thyrotropinreceptor,TSHR)结合后，提高甲状腺的摄碘能力.freelmunethyroiddisease,AITD)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropinreceptor,.freel、AccessRTPCRSystem、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和发光试剂盒为Promega公司产品;兔抗TSHR是上海亚培生物科技有限公司产品;

3、质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。1.2PCR引物的设计合成根据文献报告人促甲状腺激素受体cDNA序列资料［2］，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增hTSHR膜外区cDNA编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′CAACTCGAGACCATGCTGGGCGGAATGGGGTGTTCG3′，它包涵有转录启动子、Kozak系列和XhoⅠ酶切位点;下游引物为5′TACGAATTCCTACAGGAACTTGTAGCCCATTAT3′,它包涵有转录终止子和EcoRⅠ酶切位点。1.3总RNA的提取和RTPCR冻存的约100mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破

4、碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿异丙醇，抽提组织中的总RNA，经乙醇漂洗后溶于无RNA酶灭菌去离子水。利用分光光度器测定RNA的A260和A280值。RNA样品预处理于75℃变性5min后速放冰上冷却。RTPCR反应体系：AMV反转录酶(5u/μL)1μL，DNA聚合酶(5u/μL)1μL，5×AMV/Buffer10μL，上下游引物各3μL，最后混合RNA样品加无RNA酶灭菌去离子水至50μL。混匀后置PCR仪上，逆转录反应条件设为：48℃逆转录60min，94℃预变性2min。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火60s，68℃延伸270s，45个

5、循环后，68℃终延伸10min。对RTPCR产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。1.4克隆质粒和原核表达载体的构建及鉴定促甲状腺素受体膜外区(hTSHRECD)在大肠杆菌中的表达和纯化根据TA克隆原理［3］,将TSHR膜外区片段插入pMD18T克隆载体。将TSHR膜外区(thyrotropinreceptorectodomain,TSHRECD)片段3μL(约75ngDNA)，TA克隆载体1μL(约50ngDNA)，T4DNA连接酶0.5μL，10×连接酶缓冲液5μL，加去离子水至10μL，至PCR仪上16℃过夜。将连接产物转入DH5α细菌，经IGTP/Xgal平皿(Amp+)筛选，挑

6、选单个阳性菌落，放入10mLLB培养液中，37℃振摇过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。将提纯的pMD18TETSHR重组质粒双酶切后，定向插入质粒。反应体系为pMD18TTSHRECD重组质粒5μL，10×Buffer2μL，XhoⅠ和EcoRⅠ各1μL，加水至10μL。将酶切体系37℃过夜，65℃15min灭活内切酶。经凝胶电泳后分离目的片段ETSHR，提纯浓缩后加入原核表达载体pRSETC(EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切)，再建立连接体系。连接产物导入感受态细胞，涂于琼脂平板(Amp+)，挑选阳性克隆，EcoRⅠ、XhoⅠ酶切鉴定分析后，送

7、上海华诺生物科技公司测序。测序正确质粒命名为pRSETcTSHRECD。1.5TSHRECD融合蛋白的诱导表达将重组质粒pRSETcTSHRECD转化感受态细菌BL21，氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑取单个菌落，接种于5mLLB培养基中（含氨苄青霉素），于37℃摇床过夜。次日，按1∶100转种于500mLLB培养基中，37℃振荡培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L,32℃诱导振荡培养4h,离心收集菌体，SDS