第三章基因克隆的酶学基础-1

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1、第三章分子克隆工具酶一限制性内切酶二其他分子克隆工具酶在过去20多年里，生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为DNA物理图的特殊标记，利用限制性内切酶可产生特定大小的DNA片段并使纯化这些DNA片段成为可能，获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质。对DNA进行修饰的工具的出现，为重组DNA的实现创造了条件一限制性内切酶（一）寄主的限制与修饰现象限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。

2、限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。（二）限制性核酸内切酶(restrictionednonuclease)1.限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609

3、种,II型中共有223种特异性。2.限制性核酸内切酶的命名原则1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。限制性核酸内切酶的命名原则：属名种名株名Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制

4、性核酸内切酶3.限制性核酸内切酶的分类据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单功能同源三聚体Mg2+4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有1

5、80°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μLTemperature37℃Time1-1.5h◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶图谱。③构

6、建基因文库。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。⑤改建质粒。7.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(staractivity)在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。星活性产生的原因如下：①反应体系中甘油的浓度大于5%。②酶用量过大，大于100U/微克DNA。③低离子强度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、

7、SalI、HinfI等。8.影响限制性核酸内切酶活性的因素①DNA样品的纯度DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间②DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclIMbol等，但BamHI