植物基因克隆的工具酶

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1、第二节DNA连接酶（DNAligase）一、DNA连接酶的作用1、修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键2、修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键3、连接多个平头双链DNA分子（1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切刻（nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口（gap），DNA连接酶是无法连接的；注意（3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞中及噬菌体

2、中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注意T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶二、DNA连接酶的种类T4噬菌体DNA连接酶该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链DNA分子一条带有切刻的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子DNA-RNA杂合体分子中切刻该酶可连接大肠杆菌DNA连接酶该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。具有同源互补粘性末端的不同DNA分子一条带有切刻的双链DN

3、A分子该酶可连接但该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接T4噬菌体DNA连接酶：该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端)。两种酶各自的优点大肠杆菌DNA连接酶：该酶的连接产物转化细菌后，假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比较严格-----互补粘性末端)。两种DNA连接酶的比较E.coliDNAligaseT4-DNAligase来源大肠杆菌T4噬菌体分子量75,00068,000辅助因子NAD+ATP底物1.同源互补粘端2.双链分子中的单链缺口1.双链DNA分子的粘端、平端2.RNA—DNA杂和体，RN

4、A链缺口3.双链DNA分子中的单链缺口应用范围窄广泛、效率高三、DNA连接酶的反应体系DNA酶的连接作用过程1、辅助因子ATP（或NAD+）提供的激活AMP，与连接酶形成共价结合的酶-AMP复合物（腺苷酰酶）；同时释放出焦磷酸（PPi）[或烟酰胺单核苷酸NMN]。2、激活的AMP转移到DNA一条链的5’-末端磷酸基团上形成DNA-腺苷酸复合物。3、3’-OH末端对活跃的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键将缺口封起来，同时释放出AMP。酶－AMP复合物DNA－腺苷酸复合物四、影响连接反应的因素1、DNA浓度：插入片段：载体分子的摩尔比=3：1较好，一般在2-20nm

5、ol/L2、反应时间与温度：温度一般在4-16℃间，常用12℃-16℃30min-16h黏末端：20℃，30min；20℃，60min（有氢键）平末端：可使用较高温度（无氢键）3、连接酶的用量：粘末端：0.1U/µgDNA平末端：1-2U/µgDNA4、其他干扰因素如EDTA、杂蛋白质、存留有活性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。5、ATP浓度：最适0.5mmol-1mmol/L四、影响连接反应的因素第三节DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶

6、。特点：①需模板(DNA或RNA)②需有带3’-OH末端的引物③聚合方向5′→3′④同时具有3′→5′和外切5′→3′外切活性定义目前已开发的DNA聚合酶DNA聚合酶(全酶)(E.coli)Klenow片段(E.coli)T４DNA聚合酶T７DNA聚合酶TaqDNA聚合酶(耐热)DNA末端转移酶(小牛胸腺)反转录酶(依赖RNA)聚合酶依赖DNA的DNA聚合酶不依赖DNA的DNA聚合酶依赖RNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶1、DNA聚合酶的分类目前，从大肠杆菌中已分离出3种DNA聚合酶，分别为：DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ：与DNA复制有

7、关主要参与DNA的修复分子克隆中常用DNA聚合酶Ⅰ2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶，故也称为Kronberg酶。①5´3´DNA聚合酶活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)发挥聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质②3´5´核酸外切酶活性该活性识别单链，能将复制过程中3´端的错配碱基切除，从而保证DNA复制的高保真度，也称为校对功能。DNApolⅠ5´3´5´③5´3´核酸外切酶活性2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质5'3'5'3'5'

8、3'5'3'5´3´外切